[发明专利]一种异淀粉酶的基因工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种异淀粉酶的基因工程菌及其应用，属于基因工程技术领域。本发明以E.coli BW25113为宿主菌，构建了异淀粉酶的基因工程菌E.coli BW25113(A0A147KK56/pBAD HisB）。本发明基因工程菌表达异淀粉酶蛋白活性高，其酶活可达3936 U/g，生产成本低。本发明基因工程菌能够广泛应用于α‑环糊精工业生产。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，更具体地说，它涉及一种异淀粉酶的基因工程菌及其在合成α-环糊精中的应用。

背景技术

异淀粉酶是淀粉酶家族的重要成员，属于淀粉脱支酶的一种。异淀粉酶是一种内切型淀粉酶，能专一性地切开支链淀粉分支点的α-1，6-糖苷键，可以剪下整个侧支，形成直链淀粉，且不能水解直链分子中的α-1，6-糖苷键。由于异淀粉酶对底物中α-1，6-糖苷键位置的特异性强，因而被广泛应用于酶制剂或食品加工业的加工助剂。异淀粉酶单独使用可使支链淀粉变为直链淀粉，也可与糖化酶、β-淀粉酶、环糊精葡萄糖基转移酶、4-α-葡聚糖转移酶等淀粉酶配合使用生产葡萄糖、麦芽糖、环糊精、抗性淀粉等产品，缩短反应时间，提高淀粉的转化率，降低其他糖化酶制剂的使用量，从而达到增加产量、提高设备利用率、降低生产成本的目的。目前虽然国内在异淀粉酶研究上有相关报道，但现在市场上的商业化产品仍主要为进口酶制剂。目前仍急需研究可以商业化应用的异淀粉酶来扩大异淀粉酶库。

现有技术有报道异淀粉酶TfIA，来源于嗜热裂孢菌（Thermobifida fusca），其具有较高活性的酶，在大肠杆菌中能够实现重组表达。源于Thermobifida cellulosilyticaTB100菌的异淀粉酶基因A0A147KK56在核苷酸水平上与TfIA同源性高于85%，其表达的蛋白与TfIA具有相当的异淀粉酶活性。目前，A0A147KK56在大肠杆菌中的重组表达还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种异淀粉酶的基因工程菌，所述基因工程菌是以E.coli BW25113（购自Biovector NTCC INC，货号为355297）为宿主菌，表达异淀粉酶基因A0A147KK56，异淀粉酶A0A147KK56的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因工程菌的具体构建方法是：将异淀粉酶基因A0A147KK56连接到表达载体pBAD HisB（购自Invitrogen公司，产品目录号V430-01）上，得到合成质粒A0A147KK56/pBAD HisB；将合成质粒A0A147KK56/pBAD HisB转化到大肠杆菌E.coli BW25113宿主菌中，得到基因工程菌E.coliBW25113(A0A147KK56/pBAD HisB）。

所述合成质粒A0A147KK56/pBAD HisB转化到大肠杆菌E.coli BW25113宿主菌的具体步骤为：

(1)取一支储存于-80℃含有50~200 μL的E.coli BW25113感受态细胞在冰上解冻20~30 min；

(2)在合成质粒固体粉末中加入40 μL的ddH₂O，充分混匀；

(3)取2~3 μL的步骤（2）合成质粒溶液加入步骤（1）解冻后的感受态细胞中，加入过程中用手指轻轻拨弹；

(4)将步骤（3）产物在冰上放置20~30 min，再将其放置在42℃水浴锅中水浴120 s进行热击，热击完成后立即取出放回冰上静置2~5 min；

(5)加入800 μL的2YT液体培养基，并在振荡频率为200 rpm的37℃振荡培养箱培养40min；

(6)取步骤（5）的转化菌液50 μL涂布于2YT固体培养基平板上，于37℃培养10~12 h；

(7)挑选单菌落至含100 μg/mL氨苄青霉素的抗性液体2YT培养基中，于37℃培养6~8h；

(8)取等体积菌液与等体积无菌80%（体积）甘油溶液混合放置于保菌管，储存于-80℃冰箱，备用。

所述异淀粉酶的基因工程菌诱导产酶的具体方法如下：