[发明专利]一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法

说明书

本发明公开了一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法。本发明所提供的单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法，包括利用超临界法从猪脑粉中提取总脂，利用硅胶柱法纯化总脂获得总神经节苷脂，利用固定化酶以总神经节苷脂为底物转化制备单唾液酸四己糖神经节苷脂，以及利用反相硅胶纯化转化产物获得高纯度单唾液酸四己糖神经节苷脂(纯度≥95％)的步骤。实验证明，本发明提供的单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法，工艺简单，生产周期短，避免使用大量有毒有机试剂，节能环保，并可以提高单唾液酸四己糖神经节苷脂的产率为天然含量的2倍。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中一种制备单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法。

背景技术

神经节苷脂(GLS)是一种含唾液酸的酸性鞘糖脂，由鞘氨醇、脂肪酸和低聚糖链组成。神经节苷脂在多种生物过程中发挥重要作用。其中，单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)能穿透血脑屏障，对脑疾病有很好的治疗作用，临床上已用于治疗阿尔茨海默病、帕金森病、中风等神经系统疾病。GLS广泛分布于哺乳动物组织，尤其是脑和神经组织。1957年，Folch等人用溶剂萃取法从各种组织中提取总脂提取物。作为一种强有力的工具，色谱法被广泛用于从组织中分离纯化GLS，如单级硅酸柱、多孔硅胶柱、反相LyrSRORB RP8或BordApkRP18柱、DEAE-Sephadex A25柱和医珠微珠ADSO，RIP液相色谱法、LIPSEP凝胶色谱法、Sephadex LH-20和硅胶离心液相色谱法。上述方法虽然大大促进了GLS的分离纯化，但仍存在操作步骤复杂、成本高、环境污染、收率低、检测手段复杂等问题。

在我国，GM1注射液的原料为猪脑。GM1的天然含量很低，占猪脑湿组织的0.02％，单纯依靠从大脑中提取制备GM1是比较困难并且成本较高。根据结构相似性，可以从多唾液酸神经节苷脂GD1a、GD1b和GT1b中除去末端唾液酸制备GM1。该过程可采用化学水解法和酶水解法。化学水解法的优点是方法简单，易于实现，缺点是反应专一性差，副产物多，并且对环境具有一定的污染性。酶是一种催化剂，具有一些优良的性质(高活性、选择性和特异性)，可以执行最复杂的化学过程。唾液酸酶(neuraminidases，ec 3.2.1.18)广泛分布于生物体内，参与唾液酸的代谢。科学家们已经做出了更多的努力，用唾液酸酶产生菌或者重组唾液酸酶将GLS转化为GM1，再利用适当的方法进行纯化。酶转化法优势明显，但是也存在一定的问题，利用唾液酸酶产生菌直接转化，会引入微生物产生的次生代谢产物，利用重组唾液酸酶则成本较高，这些因素都导致了GM1注射液价格较高，影响了GM1的临床应用。

超临界CO₂萃取(SCE)，采用无污染的CO₂在超临界状态下的特殊溶解能力，通过合适的携带剂可以实现GLS的提取，并且在恢复常压后以气体形式排放，对环境友好性高。从生物实体到工业反应器的酶工程是一个非常令人兴奋的目标。幸运的是，固定化，已被揭示为一个非常强大的工具，以改善几乎所有的酶性能，它还可以让酶的回收和再利用很容易。酶固定化的基本方法可分为五种：吸附法、共价结合法、包埋法、微胶囊法和交联法。可重复使用的固定化酶由于其高效的重复使用和反应器过程控制，可以降低工业生产成本。

发明内容

本发明的目的是解决上述技术中的不足，并提供一种简单、高效、低毒性、低污染的单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)制备方法，减少制备过程中氯仿的使用量，提高GM1的得率。

为达到上述目的，本发明所设计的具体方法如下：

1、将猪脑组织洗净除杂匀浆，加入3-4倍体积的预冻在-20℃的丙酮，离心，将新鲜猪脑制备为脑丙酮粉，将丙酮溶液回收。

2、将上述方法中获得的丙酮粉装入提取袋中，放入二氧化碳超临界萃取仪(SCE)的提取釜中，泵入乙醇溶液携带剂，调温，加压。在提取时间结束后，减压调温，经分离釜获得脑总脂，减压干燥获得脑总脂干粉。