[发明专利]酸浆类块根体诱导发生的方法及类块根体介导的遗传转化方法

说明书

本发明属于生物技术与组织培养领域，具体涉及酸浆类块根体诱导发生的方法及类块根体介导的遗传转化方法。本发明的诱导酸浆类块根体发生的方法包括酸浆无菌苗的培养；类根体诱导培养基(RHI‑M)诱导酸浆的叶片产生类根体；RTB诱导培养基(RTB‑M)诱导类根体产生RTB结构；将诱导出的RTB结构转至分化培养基(RTBR‑M)诱导胚体萌发成丛生芽；将丛生芽转至生根培养基等步骤。本发明可快速、高效诱导酸浆RTB结构，并且可以酸浆叶片为转化外植体通过RTB介导的方法成功转化外源基因；所诱导出的RTB结构可离体成苗，成苗率100％。

技术领域

本发明属于生物技术与组织培养领域，具体涉及酸浆类块根体诱导发生的方法及类块根体介导的遗传转化方法。

背景技术

酸浆具有较高的食用和药用价值，富含胡萝卜素、类胡萝卜素酯、酸浆苦素A 和多糖，具有抗高血糖、抗菌和消炎作用，还有排毒、利尿的功效，被广泛用于溃疡、幽门螺杆菌、肝损伤的治疗。

体细胞胚胎发生是植物体细胞在重编程发育后被诱导形成或自发转化成胚性细胞的无性生殖过程，是良好的植物遗传转化受体系统和植物生物反应器底物，如人参毛状根。类块根体(Rhizoid tuber，RTB)是一种不同于常规的体细胞胚发生新型结构，可用于植物组织或器官悬浮培养，还可用于种质保存和基因改良。

现有技术对酸浆的研究多集中于该植物的次生代谢物质的活性检测以及药用有效成分分析等方面。酸浆类块根体(RTB)诱导发生与RTB介导遗传转化仍存在以下技术难题，如培养基种类的筛选、种子萌发、植物生长调节剂种类与浓度筛选、类根体的辨识与判定、最佳外植体的筛选、RTB胚体分化萌发的培养基筛选以及农杆菌侵染时段的选择等。因此，对酸浆体细胞胚介导的高效再生与遗传转化体系方面的研究，尚未见系统报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酸浆类块根体诱导发生的方法。

本发明的再一目的在于提供类块根体介导的遗传转化方法。

根据本发明具体实施方式的酸浆类块根体诱导发生的方法，包括以下步骤：

(1)培养酸浆无菌苗；

(2)选取酸浆无菌苗的叶片为外植体，置于类根体诱导培养基上，于暗条件下诱导产生类根体结构，其中，类根体诱导培养基包括以下成分：1/2MS盐、MS有机、 5.0mg/L NAA、3.6g/L结冷胶，类根体诱导培养基的pH为5.8；

(3)将诱导出的类根体转移至RTB诱导培养基中，于光下诱导类块根体结构，其中，RTB诱导培养基包括以下成分：MS盐、MS有机、10.0mg/L TDZ、3.6g/L 结冷胶，RTB诱导培养基的pH为5.8；

(4)将切离的类块根体结构，置于RTB胚体再分化培养基中，诱导胚体的萌发，其中，RTB胚体再分化培养基包括以下组分：MS盐、MS有机、2.5mg/L BAP、 7.8g/L琼脂粉，RTB胚体再分化培养基的pH为5.8；

(5)将萌发的胚体转移至生根培养基上，诱导生根，其中，生根培养基包括以下组分：1/2MS盐、1/2MS有机、0.05mg/L NAA、10g/L蔗糖、7.8g/L琼脂粉，生根培养基的pH为5.8；

(6)炼苗、驯化、移栽。

根据本发明具体实施方式的酸浆类块根体诱导发生的方法，所述步骤(1)中，选择健康饱满的酸浆种子，消毒后，播于MS培养基，于25℃，16h光照/8h黑暗，光照度为150μmol.m^-2s^-1的组织培养条件下培养酸浆无菌苗，其中，MS培养基包括以下组分：MS盐、MS有机、30g/L蔗糖、7.8g/L琼脂粉，MS培养基的pH为5.8。