[发明专利]基因目标区域的富集方法及体系

说明书

本发明首先提供了一种基因目标区域的富集方法，包括：(1)通过特异性探针扩增包含目标区域的片段化DNA，以提供捕获延伸产物，所述的特异性探针包括与所述片段化DNA的目标区域互补的序列，且其3’末端和5’末端核苷酸均被修饰；(2)向步骤(1)所提供的捕获延伸产物中加入连接酶，以提供连接产物。本发明其次提供了一种基因目标区域的富集体系，适用于本发明提供的基因目标区域的富集方法。本发明所提供的富集方法操作简单、结果可靠，应用于短片段DNA可以最大程度的减少原始分子尤其是稀有原始分子的损失，高效地富集目标分子。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种基因目标区域的富集方法及体系。

背景技术

基因测序技术自上世纪七十年代问世以来已经历了近半个世纪，1985年PCR技术的横空出世推动了整个分子生物学领域的发展。下一代测序技术(NGS)具有准确、灵敏、通量高的优点，随着测序成本的不断降低，其应用范围不断扩大，但其应用也受到了需求多样化且费时费力的文库构建这一步骤的制约。在对临床样本比如血浆样本的建库过程中，DNA的存在形式通常是短片段的，受损的，单链或部分双链的，对于这些存在形式的尤其是片段小于200bp的DNA来说，现有的PCR技术并不能做到很好的捕获和富集。

对于微小DNA片段的富集，现有技术仍主要使用传统PCR建库方法，或先加接头连接再扩增比如杂交捕获法。但对于前者来说，由于需要双端引物，极大限制了适合扩增的片段的长度，且存在扩增中的偏好性导致产物的高不均一性，以及指数扩增累积的错误导致后续测序结果不准确的问题；而对于后者，虽然对待富集片段长度的要求没有PCR高，但需要先进行连接反应，而连接的效率通常只有20％～50％，导致捕获效率低下，还存在因连接困难容易丢失稀有分子的问题。为了解决NGS的建库问题，近期发展起来的技术还包括诸如分子倒置探针、多重PCR等。分子倒置探针与杂交捕获技术相比，特异性较好，但其口袋状探针设计复杂，也不适用于微小DNA片段的富集。多重PCR技术适合大规模样本，应用最为广泛，但要么引物设计要求极高且扩增子均一性差，要么扩增产物均一性较好但对起始样本浓度要求很高，同样不适用于起始浓度低的微小DNA片段的富集。这些现有技术构建文库时通常需要双端引物，为了去除接头二聚体污染必然引入纯化步骤，这导致小片段的双链DNA、受损伤的双链DNA和单链DNA分子的信息丢失。然而，在一些转录活跃的基因组区域恰恰是这些存在形式的DNA。综上所述，现有技术对片段化的，尤其是200bp以下的微小DNA进行富集的需求严重未能满足，而找到高效富集片段化DNA目标区域的方法，突破连接效率对富集效果的瓶颈，抑制非目的连接产物的产生，最大程度的捕获稀有分子并保持产物的均一性，是本发明要解决的主要技术问题。申请人在申请号为2019100024085的申请中，已先行确立了先用特异性探针线性扩增目标区域再连接接头实现富集的技术方案，主要的应用方向是基于二代测序的核酸检测。本发明将用另一思路解决片段化DNA靶向富集的问题。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的一个目的在于提供一种基因目标区域的富集方法，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明首先提供一种基因目标区域的富集方法，包括：

(1)通过特异性探针扩增包含目标区域的片段化DNA，以提供捕获延伸产物；

所述特异性探针包括与所述片段化DNA的目标区域互补和不互补的序列，且所述特异性探针的3’末端和5’末端核苷酸均被修饰；

(2)向步骤(1)所提供的捕获延伸产物中加入连接酶，以提供连接产物，所述连接产物包括环化连接产物和线性连接产物。

本发明另一个目的在于提供一种用于富集片段化DNA目标区域的体系，包括适用于本发明提供的基因目标区域富集方法的特异性探针和连接酶。

附图说明

图1是本发明实施例中对于目标区域富集方法的流程示意图。