[发明专利]基因目标区域的富集方法及体系

权利要求书

1.一种基因目标区域的富集方法，包括：

(1)通过特异性探针扩增包含目标区域的片段化DNA，以提供捕获延伸产物；

其特征在于，所述特异性探针包括与所述片段化DNA的目标区域互补和不互补的序列，且所述特异性探针的3’末端和5’末端核苷酸均被修饰；

(2)向步骤(1)所提供的捕获延伸产物中加入连接酶，以提供连接产物，所述连接产物包括环化连接产物和线性连接产物。

2.如权利要求1所述的基因目标区域的富集方法，其特征在于，

所述步骤(1)中，所述片段化DNA包含双链DNA、单链DNA和cDNA，所述片段化DNA的长度为25～200bp；

和/或，所述步骤(1)的扩增体系中还包括DNA聚合酶和dNTP。

3.如权利要求2所述的基因目标区域的富集方法，其特征在于，

所述DNA聚合酶具有3’-5’外切酶活性；

和/或，所述dNTP还偶联有标记分子，所述标记分子优选为生物素。

4.如权利要求1所述的基因目标区域的富集方法，其特征在于，所述步骤(1)的扩增体系中还包括：

活性物质，所述活性物质在所述特异性探针结合所述片段化DNA的目标区域后，用于切除所述特异性探针的3’末端修饰基团；

优选的，所述活性物质是核酸酶。

5.如权利要求1所述的基因目标区域的富集方法，其特征在于，

所述特异性探针还包括能被测序系统识别的通用序列；

和/或，所述特异性探针的3’末端核苷酸的3位羟基被取代；

和/或，所述特异性探针的3’末端核苷酸的2位甲氧基被取代；

优选的，所述特异性探针的3’末端的取代基团选自氢原子、C3Spacer基团、C6Spacer基团、磷酸基团或氨基基团；

和/或，所述特异性探针3’端尾部区域包含错配碱基；

和/或，所述特异性探针的5’末端核苷酸的5位羟基被取代；

优选的，所述特异性探针的5’末端的取代基团选自磷酸基团或腺苷基团。

6.如权利要求1所述的基因目标区域的富集方法，其特征在于，

所述步骤(2)的连接体系中包括单链连接酶，所述单链连接酶优选为T4RNA连接酶或热稳定性RNA连接酶。

7.如权利要求1所述的基因目标区域的富集方法，其特征在于，

(3)在所述特异性探针上与所述目标区域不互补的序列中设置酶切位点，并在步骤(2)后加入内切酶，用于在所述酶切位点切割步骤(2)提供的连接产物中的环化连接产物以提供线性连接产物；

优选的，所述酶切位点是尿嘧啶，所述内切酶是ssDNA内切酶或USER酶。

8.如权利要求7所述的基因目标区域的富集方法，其特征在于，还包括：

(4)在所述步骤(2)后，PCR扩增所述步骤(2)提供的连接产物；

优选的，所述步骤(4)中，PCR扩增引物具有与所述特异性探针互补的序列，且与所述目标区域的序列不互补；

更优选的，与所述特异性探针互补的序列为测序通用序列；和/或，

(5)在所述步骤(3)后，PCR扩增所述步骤(2)和步骤(3)提供的连接产物；

优选的，所述步骤(5)中，PCR扩增引物具有与所述酶切位点两侧的序列互补的序列；

更优选的，与所述酶切位点两侧的序列互补的序列为测序通用序列；

和/或，在在所述步骤(1)至(5)的任意步骤后进行产物纯化。