[发明专利]基于LAMP技术的转基因玉米Bt176相关基因检测方法及试剂盒

说明书

本发明属于转基因玉米相关成分真伪鉴定方法，具体地说是利用环介导等温扩增(LAMP)技术检测玉米内源ivr基因和转基因玉米品系Bt176中的外源抗虫cry1Ab基因的方法。该方法根据玉米内源ivr基因和转基因玉米品系Bt176中的外源抗虫cry1Ab基因设计了特异性的LAMP引物，并提供了配套的试剂盒、检测方法和用途。本发明结合可视化报告方式，以中性红pH指示剂进行比色检测可实现一步可视化的比色检测。本发明在等温条件下进行，无需精密的变温设备，便捷、准确、分辨率高，检测过程无需开盖操作，适合于现场快速检测。

技术领域

本发明属于转基因玉米相关成分检测鉴定方法，具体地说是利用LAMP技术分别检测玉米内源ivr基因和转基因玉米品系Bt176中的cry1Ab基因的方法。

背景技术

自1983年首次获得转基因植物以来，转基因技术(genetically modifiedorganisms，GMOs)发展十分迅速，并已应用于农业、医药、工业等多个领域。1996年转基因作物开始商业化种植，全球转基因作物的种植面积逐年增加。然而，转基因作物对于人体健康、生态环境等的风险一直存在争议，为了规范管理转基因作物、保障消费者的知情权，世界各国都在努力制定相应的法律和法规,以加强对转基因作物及其产品的管理。因此，亟需建立一套快速、简便、准确的快速检测方法，建立转基因生物安全检测技术体系，以满足相关检验机构的日常现场快速检测的需求。

随着分子生物学技术的发展，许多以DNA分子为目标的检测方法已被广泛应用。目前检测转基因作物的方法主要有定性PCR法、实时荧光定量PCR法(RT-PCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)等。定性PCR技术操作繁琐，实时荧光定量PCR法检测成本高，且两者都难以实现现场检测。环介导等温扩增技术(LAMP)技术是一种在等温条件下进行的核酸体外扩增技术，在较短的反应时间内表现出较高的灵敏度和扩增效率，目前LAMP方法已经成为最常用的等温扩增手段之一。但目前常用的LAMP反应产物分析手段为实时荧光报告的方式、终点荧光/浊度报告法，需配备专用检测设备，同样难以适用于现场快速筛查。近年来，可视化分析方法在快速现场检测中展现优势。可视化染料比色分析既提高了肉眼的识别率，操作又更为简单，在保证其准确率的情况下，可直接用于快速的现场检测，有报导利用pH指示剂中性红(neutral red,N-red)作为一步可视化的报告方法，可使LAMP技术在现场快速检测领域具有更大的优势。

Bt176玉米是由瑞士先正达公司研制生产，是利用基因工程技术分别将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)亚种kurstaki的cry1A(b)基因、土壤细菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因等外源基因导入玉米中而获得的抗玉米螟和耐草铵膦转基因品种。自1995年在美国首次准许无限制种植以来，Bt-176玉米已经在许多国家和地区大面积种植并作为食品和饲料广泛应用。本发明即是针对转基因玉米品系Bt176提供检测相应基因成分的特异性LAMP引物、检测试剂盒、检测方法及其用途。

发明内容

本发明的目的是提供基于LAMP技术检测玉米内源ivr基因和转基因玉米品系Bt176中的cry1Ab基因的LAMP引物、试剂盒、检测方法和用途。

本发明玉米内源ivr基因检测的特异性LAMP引物是根据玉米内源ivr基因DNA序列的保守区域设计的。从GeneBank中查找到玉米内源ivr基因设计了LAMP引物。其核苷酸序列如下所示：

外引物ivrB3：ACCAGACGCCGTTGGC

外引物ivrF3：ACGCAGGTCCGCTGTA

内引物ivrBIP：TCTCGCGCGACCTCCTCCATACGGGTGATCGGGCAC

内引物ivrFIP：TGCCCCATACCGCGGAGTCACAAGGGCTGGTACCACC

环引物ivrLB：GCACCTACCGCTGGCCAT