[发明专利]利用非渗透抗冻剂和开放式载具冷冻保存石斑鱼胚胎方法

说明书

本发明涉及一种利用非渗透抗冻剂和开放式载具冷冻保存石斑鱼胚胎方法，属于低温生物学中鱼类胚胎超低温保存技术领域，所述方法以1mol/L非渗透性糖溶液为抗冻剂，获得发育至肌节期、尾芽期或胚体转动期胚胎进行冷冻保存；开放式载具为两端开口塑料管，一端用筛绢网封口；将胚胎放入冷冻剂中处理4‑10分钟；之后将处理胚胎倒入开放式载具中，底部开口朝上垂直浸入液氮中冷冻保存；所述方法冷冻保存胚胎数量大，且不会对鱼类胚胎细胞造成“溶液损伤”，冷冻胚胎成活率和孵化率高，利用本发明方法冷冻保存云纹石斑鱼胚胎成活率可达到31.30％，孵化率可达到41.28％。

技术领域：

本发明属于低温生物学中鱼类胚胎超低温保存技术领域，具体地涉及一种利用非渗透抗冻剂和开放式载具冷冻保存石斑鱼胚胎方法。

技术背景：

鱼类胚胎冷冻保存研究至今只有约60年的历史。由于鱼类胚胎体积大(1-7mm)，细胞通透性低，双层膜，卵黄含量高，冷冻时极易形成内部冰晶，冷冻损伤敏感性高，其冷冻保存较鱼类精子和哺乳动物胚胎困难，仍处于探索研究阶段，尚未能应用于实际生产和种质资源库建立。

目前鱼类胚胎冷冻保存普遍使用0.25ml细管为胚胎冷冻主要承载工具，含有高浓度混合抗冻剂的玻璃化溶液为冷冻保护剂，一般采用逐步添加玻璃化液的方式进行渗透处理。但由于细管作为载具，每管最多能盛装20-25枚胚胎，单位时间内胚胎冷冻数量有限，不能进行大批量冷冻实验，限制了鱼胚冷冻保存胚胎成活数量；而且一般冷冻保护剂要想形成玻璃化的浓度至少达到40％-60％(华泽钊,任禾盛.低温生物医学技术.北京:科学出版社,1994)，当胚胎暴露于高浓度抗冻剂时间过长时，会对胚胎结构和功能造成明显损害，导致胚胎成活率和孵化率降低，甚至导致玻璃化冷冻后成活胚胎因畸形而无法继续发育和培养。

发明内容：

为解决上述技术问题，本发明提供一种利用非渗透抗冻剂和开放式载具，进行快速冷冻保存云纹石斑鱼的方法，该方法可以提高胚胎的冷冻保存效果，并且可以大大缩短冷冻过程所需时间，提高单位时间内胚胎冷冻数量。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

一种利用非渗透抗冻剂和开放式载具冷冻保存石斑鱼胚胎方法，所述方法包括以下步骤：

(1)非渗透性抗冻剂配制：以高温灭菌过的过滤海水为基础溶液配制1mol/L非渗透性糖溶液；所述的糖为蔗糖、海藻糖或葡萄糖中的一种；

(2)石斑鱼胚胎的收集和培养：获得云纹石斑鱼受精卵，将受精卵在22-24℃海水培养，等胚胎发育至肌节期、尾芽期或胚体转动期进行冷冻保存；

(3)开放式载具制备:准备40-50ml左右塑料管和筛绢网，塑料管高100-116mm，直径28-30mm，塑料管两端开口，一端用筛绢网封口；

进一步，所述的筛绢网的网目直径为0.180mm，规格为60×60mm。

(4)胚胎冷冻：将配制好的非渗透性糖溶液加入培养皿中，并放置一定数量云纹石斑鱼胚胎，处理4-10分钟；之后将处理胚胎倒入所述步骤(3)的开放式载具，底部开口朝上垂直浸入液氮中冷冻保存；若长期保存，在冷冻20分钟后，将另一端开口封堵，置于液氮罐中长期存储；

(5)胚胎解冻和培养：将高温灭菌过的过滤海水置于玻璃烧杯中，并将过滤海水温度控制在25-35℃；将所述步骤(4)中含冷冻胚胎的开放式载具置于过滤海水中，轻轻搅动并解冻；然后，将烧杯放置于26℃的生化培养箱中，半小时后更换海水，继续培育。

本发明与现有技术相比的有益效果如下：

(1)本发明使用的抗冻剂只有非渗透性的蔗糖、海藻糖或葡萄糖，成份简单、无毒性，不会对鱼类胚胎细胞造成“溶液损伤”。其它鱼类胚胎冷冻保存液中含有渗透性较强的小分子抗冻剂(二甲基亚砜、甲醇等)，由于其毒性较强，不可避免的对胚胎造成“溶液损伤”，从而降低冷冻胚胎存活率。