[发明专利]近红外发光的生物质量子点和对ONOO-特异性响应的NIR比率荧光探针及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了近红外(NIR)发光的生物质量子点(BQDs)和对过氧亚硝酸根(ONOO^‑)特异性响应的NIR比率荧光探针的制备方法和应用。NIR比率荧光探针及其制备方法，包括先从冬青树叶(Holly leaves)中制备叶绿素粗提取液，再制备生物质量子点(HL‑BQDs)，最后制备NIR比率荧光探针：HL‑BQDs‑Cy7。本发明提出的NIR比率荧光探针，对ONOO^‑具有特异性响应，检定细胞线粒体内ONOO^‑含量表现出高的灵敏性和好的选择性，实现了小鼠体内内源性ONOO^‑的比率荧光成像。

技术领域

本发明涉及化学和生物医学技术领域，尤其是涉及生物体及细胞中生物信息检测的材料，具体为近红外发光的生物质量子点和对ONOO-特异性响应的NIR比率荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

过氧亚硝酸根(ONOO-)是生物体内一种重要的活性氧，是由体内的一氧化氮自由基(NO·)和超氧阴离子自由基(O2-·)快速反应生成，其生成位点主要在细胞中的线粒体。由于ONOO-具有较强的氧化性和亲核性，可以与各种蛋白质、脂质体、核酸等发生反应，从而造成细胞损伤。

准确测定ONOO-的含量,可以提供精准的生物学信息，对于在分子水平上解释ONOO-相关的损伤机制具有重要的意义。另外，细胞损伤的长期积累与心血管疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、炎症甚至癌症息息相关。因此，对ONOO-的成像和定量分析有助于ONOO-相关疾病的早期诊断。目前检测过ONOO-的方法有很多，其中包括电子顺磁共振光谱法(EPR)、紫外可见吸收光谱法、色谱法等，现有的检测方法要么实验设备比较昂贵，要么因为检测物质的原因导致灵敏度较低，选择性较差，且不适合用于细胞和活体中 ONOO-的成像检测等问题。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术不足，提供一种近红外发光的生物质量子点及对ONOO-特异性响应的NIR比率荧光探针，可以实现低成本检测细胞线粒体内和活体内ONOO-含量。发明内容包括近红外发光的生物质量子点及对ONOO-特异性响应的NIR比率荧光探针的制备方法和其应用。检定细胞线粒体内和活体内ONOO-含量能表现出高的灵敏性和好的选择性。

本发明第一方面提供了一种近红外发光的生物质量子点的制备方法。制备方法包括如下过程，其中材料份是按份搭配：

S11:制备叶绿素粗提取液，将18-22g洗净晾干的冬青树叶和18-22mL 的无水乙醇在破碎装置中打碎，再将破碎后的冬青树叶溶液倒入烧杯中，加入8-11mL丙酮，搅拌均匀后静置，过滤得到叶绿素粗提液；

S12:在圆底三口烧瓶中加入18-21mL油酸及0.04-0.06g NH₂-PEG-NH₂，充入氩气并在搅拌下升温至245-255℃，待溶液变成橙红色后停止加热，冷却至室温后加入4-6mL叶绿素粗提取液，搅拌均匀后继续升温至175-185℃，在搅拌下反应160-200min，冷却至室温后，加入12mol/L的HCl至溶液为强酸性，再在27-33℃下搅拌反应11-13h；

S13：将混合液转移至分液漏斗，加入0.8-1.2mL超纯水，摇匀，静置分层后，将下层溶液其转移至烧杯中，并用饱和NaOH溶液调节溶液pH至中性，用水系滤膜过滤，以去除其中的大颗粒物质；

S14：将滤液转移至透析袋中，在超纯水中透析22-25h后，得到生物质量子点HL-BQDs溶液。

具体的，在步骤S13中，用0.2-0.4μm水系滤膜过滤；在步骤S14中，透析袋的型号为MWCO:800-2000Da。

本发明第二方面提供近红外(NIR)发光的生物质量子点，其是按照所述的近红外(NIR)发光的生物质量子点的制备方法制得。