[发明专利]一种EMSA试剂盒及其应用

说明书

本发明提供了一种EMSA试剂盒及其应用，所述试剂盒包括荧光标记探针；所述荧光标记包括Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、Alexa Fluor 488或FITC中的任意一种或至少两种的组合。本发明采用荧光基团替代放射性P³²或生物素对探针进行标记，显著提高了EMSA实验的可操作性、特异性、灵敏度和结果的准确性，经过反复优化及对比，每个样品仅需10^‑6～10^‑7μM探针即可清晰检测到DNA特异性结合蛋白，并且在电泳后即刻得到实验结果，无需其他处理，操作简便、结果准确、检测速度快，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种EMSA试剂盒及其应用。

背景技术

电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)是一种研究DNA结合蛋白与其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析蛋白质与DNA的相互作用。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已推广用于研究RNA结合蛋白与其相关的RNA结合序列的相互作用。EMSA通常将核蛋白与P³²同位素或生物素标记的DNA或RNA探针共同孵育，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，DNA-蛋白复合物或RNA-蛋白复合物较非结合的探针的移动速度慢，从而达到分离复合物和未结合的探针的目的。

现有技术中，P³²同位素由于具有放射性已不常用，常用的生物素标记探针法在电泳过后需要将DNA结合蛋白转移到尼龙膜上，再利用链霉亲和素抗体孵育尼龙膜，使用化学发光法检测DNA结合蛋白的含量。但是，转膜这一步骤十分关键，不能保证将全部DNA结合蛋白转移到尼龙膜上，显著影响了结果的真实性。

CN107422022A公开了一种凝胶或电泳迁移率实验的结合反应体系的工作流程，具体步骤如下：步骤一，处理探针；步骤二，配胶；步骤三，预电泳；步骤四，配制结合反应体系；步骤五，电泳；步骤六，转膜；步骤七，交联固定DNA；步骤八，结合膜预处理；步骤九，化学发光反应。所述方法包括转膜步骤，对结果的准确性有显著影响。

Viagene Biotech研发了一款EMSA试剂盒，采用红外荧光染料标记的探针进行蛋白捕获，具有灵敏度高、检测速度快等优点，但存在着探针聚集明显的问题，影响了结果的准确性。

因此，提供一种新的EMSA试剂盒，提高EMSA对核酸蛋白复合物检测的准确性和灵敏性，具有重要意义和广阔的应用前景。

发明内容

为达此目的，本发明提供了一种EMSA试剂盒及其应用，所述试剂盒中的探针采用荧光基团替代放射性P³²或生物素进行标记，显著提高了EMSA的可操作性、特异性、灵敏度和结果的准确性。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种EMSA试剂盒，所述试剂盒包括荧光标记探针；

所述荧光标记包括Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、Alexa Fluor 488或FITC中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，采用荧光标记探针与蛋白反应结合，通过凝胶电泳将核酸-蛋白复合物与未结合的探针进行分离，并在凝胶电泳后成像得到实验结果，实现了核酸结合蛋白的快速、准确、特异性检测。

优选地，所述荧光标记探针的浓度为10^-6～10^-7μM。

优选地，所述荧光标记探针包括靶向转录因子的探针。

优选地，所述转录因子包括STAT3或NFAT中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述靶向的探针包括如SEQ ID NO:1所示的核酸分子；