[发明专利]一种EMSA试剂盒及其应用在审
| 申请号： | 201910864845.8 | 申请日： | 2019-09-12 |
| 公开（公告）号： | CN110487881A | 公开（公告）日： | 2019-11-22 |
| 发明（设计）人： | 刘合宾;王琰 | 申请（专利权）人： | 西交利物浦大学 |
| 主分类号： | G01N27/447 | 分类号： | G01N27/447;G01N33/68 |
| 代理公司： | 11332 北京品源专利代理有限公司 | 代理人： | 巩克栋<国际申请>=<国际公布>=<进入 |
| 地址： | 215123 江苏省*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 试剂盒 探针 特异性结合蛋白 荧光标记探针 电泳 清晰检测 荧光标记 荧光基团 灵敏度 生物素 放射性 应用 检测 替代 优化 | ||
1.一种EMSA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括荧光标记探针；
所述荧光标记包括Cy2、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、Alexa Fluor 488或FITC中的任意一种或至少两种的组合。
2.根据权利要求1所述的EMSA试剂盒，其特征在于，所述荧光标记探针的浓度为10-6～10-7μM。
3.根据权利要求1或2所述的EMSA试剂盒，其特征在于，所述荧光标记探针包括靶向转录因子的探针；
优选地，所述转录因子包括NF-κB、STAT3或NFAT中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述靶向NF-κB的探针包括如SEQ ID NO:1所示的核酸分子；
优选地，所述靶向STAT3的探针包括如SEQ ID NO:2所示的核酸分子；
优选地，所述靶向NFAT的探针包括如SEQ ID NO:3所示的核酸分子。
4.根据权利要求1-3任一项所述的EMSA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括EMSA结合缓冲液、竞争探针、目标蛋白特异抗体或无酶水中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述竞争探针为未标记探针。
5.根据权利要求1-4任一项所述的EMSA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括蛋白提取试剂和/或非特异性DNA结合蛋白结合试剂；
优选地，所述蛋白提取试剂包括细胞裂解液、蛋白酶抑制剂或PMSF中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述非特异性DNA结合蛋白结合试剂包括poly dI-dC和/或poly dA-dT；
优选地，所述非特异性DNA结合蛋白结合试剂的浓度为0.1～1μg/μL，优选为0.5～0.8μg/μL。
6.一种检测方法，其特征在于，所述方法包括采用如权利要求1-5任一项所述的EMSA试剂盒检测核酸结合蛋白的步骤。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)从样本中提取蛋白；
(2)将提取的蛋白与非特异性DNA结合蛋白结合试剂共孵育；
(3)加入荧光标记探针，孵育；
(4)进行凝胶电泳，扫描读取结果。
8.根据权利要求6或7所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述样本包括细胞、组织或外周血中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，在步骤(2)之前还包括将提取的蛋白与特异性抗体室温孵育30～60min的步骤；
优选地，步骤(2)所述孵育的温度为0～4℃；
优选地，步骤(2)所述孵育的时间为10～60min；
优选地，步骤(3)所述孵育的温度为15～30℃；
优选地，步骤(3)所述孵育的时间为10～30min。
9.一种如权利要求1-5任一项所述的EMSA试剂盒和/或如权利要求6-8任一项所述的检测方法在检测核酸结合蛋白中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述核酸结合蛋白包括转录因子；
优选地，所述转录因子包括NF-κB、STAT3或NFAT中的任意一种或至少两种的组合。
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