[发明专利]多重抗体免疫磁珠富集检测CTCs的方法

说明书

本发明为一种多重抗体免疫磁珠富集检测CTCs的方法，具体步骤为：1、抗EpCAM单克隆抗体与磁珠偶联；2.制备循环肿瘤细胞样品：取适量免疫磁珠，加入生物肿瘤细胞样本中混匀，然后用磁力分离器分离，PBS清洗，将磁珠吸附细胞悬浮于PBS溶液中，进行细胞计数，使用细胞计数板检测富集到的细胞；将适量纳米免疫磁珠加入人工肿瘤细胞血液样品中磁力分离，PBS清洗，然后将磁珠吸附细胞重新悬浮于PBS中；取样品,滴加于载玻片上，使用FICT,进行孵育，使用流式细胞仪对富集的细胞进行检测，肿瘤细胞‑荧光标记EPCAM鉴定有效性。在荧光倒置显微镜下进行计数，肿瘤细胞株细胞混入外周血后的富集、鉴定同上。极大地提高了循环肿瘤细胞检测的敏感性和特异性。

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，具体为多重抗体免疫磁珠富集检测CTCs的方法。

背景技术

检测循环肿瘤细胞有助于早期发现患者体内的肿瘤、监测患者术后体内是否出现肿瘤复发或转移、评估预后进而选择合适的治疗策略，尽早帮助患者治疗。近年来，检测循环肿瘤细胞的方法集中在免疫细胞疗法、逆转录聚合酶链反应、流式细胞术、免疫磁珠富集检测法等，但这些方法都存在不同方面的检测缺陷：

1、免疫细胞疗法：

免疫细胞疗法的原理是将特异性抗体用显色剂标记，之后通过在组织细胞原位进行抗原抗体反应以及细胞进行化学呈色，对相应的目的抗原定位、定性以及定量检测分析的技术方法。免疫细胞疗法的缺点是：检测到的细胞数量很少，灵敏度仅为105-106。因为免疫细胞化学检测循环血液中的肿瘤细胞时，每个载玻片上可检测的细胞样品量仅为5×105个细胞。但是检测肿瘤细胞的理想方法应该能够检测来自2.5×108外周血有核细胞的单个肿瘤细胞。那么，从2.5×108个有核血细胞中筛选肿瘤细胞需要制备和分析约500个载玻片，因此免疫细胞化学检测率低，难以从外周血中的大量单核细胞中检测到非常少量的循环肿瘤细胞，简单的免疫细胞疗法不能用于肿瘤患者循环肿瘤细胞的临床检测。

2、逆转录聚合酶链反应：

逆转录聚合酶链反应是在逆转录酶的作用下合成与标记的mRNA互补的cDNA，然后以cDNA为模板PCR周期扩增，进而制备大量的所需要的cDNA片段，大大提高了灵敏度。逆转录聚合酶链反应检测方法的缺点是：由于目的mRNA的非特异性表达、标本和PCR产物的污染，PCR扩增条件的不正确控制以及非特异性细胞的非法转录水平低，逆转录聚合酶链反应方法的检测结果具有高假阳性率。同时，逆转录聚合酶链反应的测试过程复杂，测试耗时较长。因此，逆转录聚合酶链反应在循环肿瘤细胞的检测中可能缺乏某些特异性，这限制了其临床诊断使用价值。

3、流式细胞术：

流式细胞术是一项应用激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型技术。流式细胞术检测循环肿瘤细胞的缺点是使用流式细胞术检测循环肿瘤细胞的价值在很大程度上取决于可以分析的细胞数量。通过流式细胞术检测的靶细胞的灵敏度仅为1/10⁴，而外周血中的肿瘤细胞的数量通常小于1/10⁶。

发明内容

针对现有技术上出现的灵敏度低、检测率低、测试过程复杂、测试耗时较长、假阳率高等问题，本发明利用多重抗体免疫磁珠结合流式细胞术的方法检测循环肿瘤细胞可以大大改善这一系列检测缺陷。

本发明提供如下技术方案：一种多重抗体免疫磁珠富集检测CTCs的方法，包括如下步骤：

S1.抗体与磁珠偶联：

1)抗体偶联前，在4度下，经过三次透析，过夜，储存在PBS中，将浓度调整到7μmol/L、14μmol/L、21μmol/L、28μmol/L；

2)纳米免疫磁珠的制备：