[发明专利]多重抗体免疫磁珠富集检测CTCs的方法

权利要求书

1.一种多重抗体免疫磁珠富集检测CTCs的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.抗体与磁珠偶联：

1)抗体偶联前，在4度下，经过三次透析，过夜，储存在PBS中，将浓度调整到7μmol/L、14μmol/L、21μmol/L、28μmol/L；

2)纳米免疫磁珠的制备：

取4份300μL浓度为2mg/mL活化的羧基磁珠，分别加入40ul 1μmol的HLA-G抗体、2μmolCK8/18抗体、2μmol EPCAM抗体、2μmol HER-2抗体，混合在1ml的离心管中，于室温下混合3h，用1ml PBS缓冲液做清洗液清洗三次，加入300μL 0.25mol/L甘氨酸混合25min，封闭剩余的醛基；再用1ml PBS缓冲液做清洗液清洗三次；加入含有质量百分比2.5％BSA的PBS溶液混合30min，封闭非特异性的吸附位点，再用1ml清洗液(PBS缓冲液)清洗三次，加入300μLPBS缓冲液漩涡震荡，即得到1：2:2:2比例混合的多重抗体免疫磁珠；

S2.制备循环肿瘤细胞样品：

1)实验室培养各种肿瘤细胞样本，取各种肿瘤细胞，100μL，加入1.5mL离心管中，将肿瘤细胞于外周血中制成人工样本，每种细胞为三管；

2)取5μL上述制备好的各种肿瘤细胞与5mL健康人血液混合，每种细胞制备三管；

3)取适量免疫磁珠，加入100ul生物肿瘤细胞样本中混匀，然后用磁力分离器分离，PBS清洗，将磁珠吸附细胞悬浮于PBS溶液中，进行细胞计数，使用细胞计数板检测富集到的细胞；

4)将适量纳米免疫磁珠加入1ml人工肿瘤细胞血液样品中磁力分离，PBS清洗，然后将磁珠吸附细胞重新悬浮于PBS中；取5ul样品,滴加于载玻片上，使用FICT,进行孵育，使用流式细胞仪对富集的细胞进行检测，肿瘤细胞-荧光标记EPCAM鉴定有效性。在荧光倒置显微镜下进行计数，肿瘤细胞株细胞混入外周血后的富集、鉴定同上。

2.根据权利要求1所述的一种偶联抗EpCAM抗体的免疫磁珠富集检测CTCs的方法，其特征在于，所述纳米免疫磁珠的制备的反应条件为：反应介质为0.01M PBS，PH＝7.4，温度为室温，反应时间为3h，抗体和磁珠质量比为200μg：1000μg。

3.根据权利要求1所述的一种偶联抗EpCAM抗体的免疫磁珠富集检测CTCs的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞为乳腺癌症(MCF-7)，食道癌(EC109)，非小细胞肺癌(A549)，子宫颈癌(Hela)，胃癌(NCI-N87)、结肠癌(HT29)。