[发明专利]一种基于多元自动化基因组工程在类球红细菌中实现基因编辑的方法

说明书

本发明公开了一种基于多元自动化基因组工程在类球红细菌中实现基因编辑的方法，该方法将靶向目标序列的单链DNA引入R.sphaeroidesKD131中实现了基因的替换重组，可以简化遗传操作，提高R.sphaeroides的重组效率。本发明还公开了一种合成的ssDNA。本发明还公开了所述的合成的ssDNA在类球红细菌中实现外源基因编辑的应用和在类球红细菌中实现内源基因编辑的应用。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，是关于一种基于多元自动化基因组工程在类球红细菌中实现基因编辑的方法。

背景技术

多元自动化基因组工程(Multiplex Automated Genome Engineering,MAGE)，是一种可以对细胞进行大尺度编程和进化研究的新技术。它是基于Red重组原理，在噬菌体同源重组蛋白RecT蛋白的作用下，将人工合成的多个简并寡核苷酸通过电击的方式转入细胞中，每个寡核苷酸靶定了基因组上的一段序列，结合后通过同源重组的方式替换靶定序列。区别于以往的技术，MAGE将ssDNA导入细胞中，使得Red重组效率比导入dsDNA片段有了显著提高；MAGE同时将大量靶向基因组不同部位的序列的ssDNA库转入细胞中，这样可以产生各种组合的突变型，真正实现了基因组的可编辑、可组装。该技术已被应用于大肠杆菌的基因敲除和基因替换。

辅酶Q10(Coenzyme Q10，CoQ10)是一种脂溶性醌类化合物，在药品、功能性食品和化妆品中有广泛应用。微生物发酵法生产CoQ10可以通过规模放大提高生产能力。为了提高CoQ10的产量，降低其生产成本，开发出CoQ10的高产菌株尤为重要。类球红细菌Rhodobactersphaeroides中CoQ10天然含量较高，通过对R.sphaeroides进行菌种选育可以获得CoQ10的高产菌株，但传统的物理或者化学诱变方法工作量大，且具有随机性，效率较低。本发明首次在R.sphaeroides中建立MAGE技术，以实现同时对多个基因或位点进行修饰，产生多种多样的基因突变菌株，提高突变效率。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种能够在类球红细菌R.sphaeroidesKD131中成功进行基因编辑的MAGE方法。该方法将靶向目标序列的单链DNA引入R.sphaeroidesKD131实现了基因的替换重组，可以简化遗传操作，提高R.sphaeroides的重组效率。为了验证MAGE方法在R.sphaeroide中应用的可行性，本发明的第二个目的是提供一种单链Kan-on DNA在R.sphaeroides中实现外源基因编辑的应用。本发明的第三个目的是提供一种单链crtB-offDNA在R.sphaeroides中实现内源基因编辑的应用。因为crtB基因编码的八氢番茄红素合成酶，是胡萝卜素合成的第一个酶，crtB基因的敲除会导致胡萝卜素合成的降低，使得红色减弱或者消失；同时，合成其它萜类化合物的异戊二烯前体增加，可能导致叶绿色的合成增加，使菌体呈现绿色，有利于基因编辑的检测；在辅酶Q10的生物合成途径中，胡萝卜素与合成辅酶Q10的中间产物竞争共同的前体物，crtB基因的敲除可能阻断或者减少异戊二烯前体流向类胡萝卜素的合成，从而增加辅酶Q10的产量。本发明的第四个目的是提供一种含有噬菌体同源重组蛋白recT基因的质粒pLYKQ2，将质粒转入R.sphaeroides中，以便促进基因编辑的发生。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种基于多元自动化基因组工程在类球红细菌中实现基因编辑的方法，包括如下步骤：

步骤一、构建含有Kan-off基因的质粒p102-54-Kan-off；

步骤二、将质粒p102-54-Kan-off接合转移至R.sphaeroidesKD131，菌株命名为R.sphaeroidesKD131-2；

步骤三、构建含有噬菌体同源重组蛋白recT基因的质粒pLYKQ2；