[发明专利]一种基于多元自动化基因组工程在类球红细菌中实现基因编辑的方法在审
| 申请号： | 201910862299.4 | 申请日： | 2019-09-12 |
| 公开（公告）号： | CN110607318A | 公开（公告）日： | 2019-12-24 |
| 发明（设计）人： | 孔奎权;钱秀萍;靳旭;夏兴;戈梅 | 申请（专利权）人： | 上海交通大学;上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司 |
| 主分类号： | C12N15/74 | 分类号： | C12N15/74;C12N15/90;C12N15/54 |
| 代理公司： | 31104 上海华工专利事务所(普通合伙) | 代理人： | 缪利明;赵孟琴 |
| 地址： | 200030 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 类球红细菌 合成 基因组工程 靶向目标 内源基因 外源基因 遗传操作 单链DNA 基因 应用 替换 自动化 引入 | ||
1.一种基于多元自动化基因组工程在类球红细菌中实现基因编辑的方法，其特征在于，使用合成的ssDNA将靶向修饰直接引入类球红细菌染色体，主要步骤包括：ssDNA的转化和转化后细菌的生长，在此过程中噬菌体同源重组蛋白RecT介导ssDNA退火到类球红细菌基因组的靶标序列，从而实现基因编辑。
2.如权利要求1所述的基于多元自动化基因组工程在类球红细菌中实现基因编辑的方法，其特征在于，ssDNA的构建采用人工化学合成的方法，合成长度为90bp，并在基因的5’端进行硫代磷酸酯键的修饰。
3.如权利要求1所述的基于多元自动化基因组工程在类球红细菌中实现基因编辑的方法，其特征在于，含有噬菌体同源重组蛋白recT基因的质粒pLYKQ2的构建方法为：
以pBAD为模板，利用如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的引物PCR扩增，获得阿拉伯糖启动子Para；
接着，将阿拉伯糖启动子Para克隆至pMD-19T simple，获得pMD-Para；
接着，以KpnI/XbaI双酶切pMD-Para，获得启动子Para，以相同的酶双酶切pUC18-4T-1，获得载体；
接着，将以上两个片段连接，获得含有阿拉伯糖启动子Para的质粒pUC18-4T-3；
接着，以大肠杆菌DH5α基因组为模板，利用如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的引物PCR扩增，获得噬菌体同源重组蛋白recT基因片段；
接着，将噬菌体同源重组蛋白recT基因克隆至pMD-19T simple，获得pMD-recT；
接着，以HindIII/XbaI双酶切pMD-recT，获得噬菌体同源重组蛋白基因recT，以相同的酶双酶切pUC18-4T-3，获得载体；
接着，将以上两个片段连接，获得含有噬菌体同源重组蛋白基因recT的质粒质粒pLYKQ2。
4.一种合成的ssDNA，其特征在于，ssDNA的构建采用人工化学合成的方法，合成长度为90bp，并在基因的5’端进行硫代磷酸酯键的修饰。
5.一种如权利4所述的ssDNA在类球红细菌中实现外源基因编辑的应用。
6.一种如权利4所述的ssDNA在类球红细菌中实现内源基因编辑的应用。
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