[发明专利]基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法

说明书

一种基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法，将新型的量子点纳米探针与流式细胞分析技术相结合的免疫方法用于检测自身抗AQP4抗体，突破了传统的以有机荧光染料为检测工具的瓶颈。同时利用了流式细胞分析技术具有快速检测易于标准化和自动化等优点，弥补了现有AQP4抗体检测技术的不足。能够简单快速、可重复检测AQP4抗体。

技术领域

本发明涉及生物分析化学、纳米生物技术领域，特别是涉及一种基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法。

背景技术

人体自身抗体作为自身免疫性疾病的重要血清学标志物，其快速检测对于自身免疫性疾病的诊断、治疗措施和预后评估有重要的应用价值。随着自身抗体检测方法的灵敏度和特异性的提高，相关自身免疫性疾病的诊断标准也在相应更新调整。

视神经性脊髓炎(neuromyelitis optica，NMO)是视神经与脊髓同时或相继受累的急性或亚急性炎性脱髓鞘病变。2004年Lennon等首次在NMO患者血清中发现NMO-IgG抗体，即抗水通道蛋白4(AQP4)抗体。AQP4是中枢神经系统主要的水通道蛋白，位于星形胶质细胞的足突上，是NMO-IgG的主要目标。AQP4抗体通过血脑屏障中可通过的部分进入中枢神经系统，遇到星形胶质细胞并导致细胞依赖的细胞毒性反应，星形胶质细胞足突被NMO-IgG和补体降解，继而活化巨噬细胞、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞产生一系列细胞因子、氧自由基等造成血管和实质损伤，最终导致包括轴索和少突胶质细胞在内的白质和灰质的受损。2015年已将血清抗AQP4抗体作为支持条件纳入NMO诊断标准。

目前临床上检测AQP4常用的检测方法主要包括以下两种：(1)以高表达AQP4蛋白的鼠脑组织切片为基质的间接免疫荧光分析法(Indirect immunofluorescence assay,IIF)，该方法虽然灵敏度高，但其操作复杂，对组织切片的制作要求较高，难以质控，并且要求检验人员具有丰富的神经生理学知识才能准确判定检测结果。(2)以成功表达AQP4蛋白的细胞为基质的细胞免疫分析技术(cell-based assay,CBA)，该方法特异性相对较高，但在实际检测过程中尽管设置了阴性对照，也可能由于蛋白表达量低影响检测结果的判读，而且由于转染效率的不一致，难以建立统一的质量控制标准，从而难以实现大规模商品化生产。

因此，针对现有技术不足，提供一种基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法以克服现有技术不足甚为必要。

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法，具有制备过程简单快速、可重复检测AQP4抗体的特点。

本发明的目的通过以下技术措施实现。

提供一种基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法，包括以下步骤：

(1)制备量子点聚苯乙烯QPs微球；

(2)获取AQP4蛋白的功能性片段目的基因进行表达；

(3)利用EDC-NHS活化QPs微球表面的羧基，并将活化后的QPs微球表面的羧基与AQP4蛋白的氨基进行偶联制成功能化的QPs微球；

(4)通过荧光发射峰为600nm至650nm的油溶性CdSe量子点与FITC标记的羊抗人IgG的红绿色双重荧光定位系统进行流式检测，并对已功能化后的QPs微球的检测结果进行判读。

优选的，上述步骤(1)采用化学渗透法制备QPs微球，具体过程包括：

(1.1)取1mg至10mg的PS微球分散悬浮于0.5mL至1mL的浓度为99.99％的饱和正丁醇溶液中，制成PS微球悬液；

(1.2)取0.1mg至1mg的量子点QD溶解于50μL至100μL的的浓度为99.99％的饱和二氯甲烷溶剂中并进行震荡混合，制成QD-二氯甲烷溶液；