[发明专利]基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法

权利要求书

1.一种基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法，包括以下步骤：

(1)制备量子点聚苯乙烯QPs微球；

(2)获取AQP4蛋白的功能性片段目的基因进行表达；

(3)利用EDC-NHS活化QPs微球表面的羧基，并将活化后的QPs微球表面的羧基与AQP4蛋白的氨基进行偶联制成功能化的QPs微球；

(4)通过荧光发射峰为600nm至650nm的油溶性CdSe量子点与FITC标记的羊抗人IgG的红绿色双重荧光定位系统进行流式检测，并对已功能化后的QPs微球的检测结果进行判读。

2.根据权利要求1所述的基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法，所述步骤(1)采用化学渗透法制备QPs微球，具体过程包括：

(1.1)取1mg至10mg的PS微球分散悬浮于0.5mL至1mL的浓度为99.99％的饱和正丁醇溶液中，制成PS微球悬液；

(1.2)取0.1mg至1mg的量子点QD溶解于50μL至100μL的的浓度为99.99％的饱和二氯甲烷溶剂中并进行震荡混合，制成QD-二氯甲烷溶液；

(1.3)将QD-二氯甲烷溶液以2.5μL/秒至3.5μL/秒的滴速滴加至PS微球悬液中，在室温下震荡4至5小时；

(1.4)将震荡后的混合物置于45℃至55℃水温中进行水浴加热20至25小时；

(1.5)用体积分数为20％至80％的乙醇溶液对水浴后的混合物进行离心洗涤，收集沉淀物得到QPs微球。

3.根据权利要求2所述的基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法，所述步骤(2)具体包括：

(2.1)人工合成AQP4蛋白功能性片段目的基因，并将合成后的目的基因插入到pET32a质粒载体中，获得AQP4-pET32a的重组质粒；

(2.2)将AQP4-pET32a的重组质粒转化至BL21菌株中，并加入IPTG诱导剂进行诱导表达；

(2.3)将诱导表达后得到的蛋白产物进行离心操作，分别取离心后的离心上清液和沉淀物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定；

(2.4)将诱导表达后得到的蛋白产物通过镍柱进行纯化，并采用蛋白质印迹法western-bloting再次鉴定。

4.根据权利要求3所述的基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法，所述步骤(2.2)具体包括以下步骤：

将0.1μg至0.5μg AQP4-pET32a的重组质粒与50μL至100μL体积分数为50％的BL21菌株混匀冰浴至少30分钟，随后将混合菌液置于40℃至45℃的水中进行水浴85秒至95秒，接着再置于0℃环境下冰浴2至3分钟,在35℃至40℃下、以220转每分的转速转动培养混合菌液45分钟以上，将菌液接种涂布含氨苄青霉素的琼脂平板，将琼脂平板置于35℃至40℃环境中孵育24小时以上。

5.根据权利要求说明4所述的基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法，其特征在于，所述步骤(2.3)具体包括以下步骤：挑阳性克隆，具体是在35℃至40℃环境下、以220转每分的转速转动培养基，孵育至培养基轻微混浊，将单克隆菌液分为六管且每管放置1mL菌液，按照诱导时间和IPTG稀释比例的不同进行分组，其中诱导时间分为4小时和6小时，IPTG稀释比例分为0，1:1000，1:100三种，具体分组情况如下：

1)诱导时间为4小时，IPTG稀释比例为0为一组；

2)诱导时间为4小时，IPTG稀释比例为1：1000为一组；

3)诱导时间为4小时，IPTG稀释比例为1：100为一组；

4)诱导时间为6小时，IPTG稀释比例为0为一组；

5)诱导时间为6小时，IPTG稀释比例为1：1000为一组；

6)诱导时间为6小时，IPTG稀释比例为1：100为一组。

6.根据权利要求说明5所述的基于量子点聚苯乙烯微球检测抗AQP4抗体的方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括以下步骤：

(3.1)QPs微球的预处理：取0.1mg至1mg的QPs微球加入到0.5mL至1mL的PH值为6.1，浓度为50mmol/L的MES buffer缓冲液中混合，将得到的混合物置于18000转每分的转速环境中转动5分钟以上，进行离心操作；

(3.2)活化QPs微球：将离心后的产物重置于100μL至500μL的PH值为6.1，浓度为50mmol/L的MES buffer缓冲液中，并分别加入5μg/μL至20μg/μL的EDC试剂和5μg/μL至20μg/μL的NHS试剂混合，在室温环境下对混合后的产物震荡30分钟以上；

(3.3)终止活化：将震荡后的混合产物置于18000转每分的环境中转动5分钟以上，进行离心操作，并在离心后的产物中加入0.5mL至1mL的PBS试剂进行洗涤操作2次到3次；

所述PBS试剂的PH值范围为7.2至7.4，浓度为0.01mol/L；

(3.4)QPs微球偶联AQP4蛋白：将AQP4蛋白与QPs微球置于0.5mL至1mL的PBS试剂中混合，并将混合后的产物置于3℃至45℃的温度中过夜或者在室温的条件下震荡2小时至4小时，完成QPs微球偶联AQP4蛋白的操作；

所述PBS试剂的PH值范围为7.2至7.4，浓度为0.01mol/L；

(3.5)封闭：在震荡后的混合产物中加入质量浓度3％至5％的BSA试剂，在室温的条件下将混合物震荡30分钟以上；

(3.6)终止反应：将加入质量浓度3％至5％的BSA试剂震荡后得到的产物置于18000转每分的转速中转动5分钟以上进行离心操作，并在离心后的产物中加入0.5mL至1mL的PBS试剂进行洗涤操作2次到3次，最后加入100μL至500μL的PBST试剂进行对功能化的QPs微球的重悬；

所述PBS试剂的PH值范围为7.2至7.4，浓度为0.01mol/L；

所述PBST试剂的PH值范围为7.2至7.4，浓度为0.01mol/L。