[发明专利]一种猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株及其构建方法和应用。该猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株是以猪伪狂犬病病毒变异株PRV HNxy为亲本毒株，使其gI、gE、US9和US2蛋白失活而获得的减毒株。本发明猪伪狂犬病病毒变异株的基因缺失毒株可制备成活疫苗或灭活疫苗，对猪伪狂犬病具有很好的免疫保护效果，接种猪只没有出现任何临床症状，安全性高，适于作为防控伪狂犬病的疫苗候选株。

技术领域

发明涉及一种猪伪狂犬病病毒基因缺失毒株的构建，还涉及该基因缺失毒株在制备和防治伪狂犬病中的应用，属于基因工程技术和病毒学领域。

背景技术

猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)或者说猪疱疹病毒1型(suid herpesvirus 1,SuHV-1)感染猪或其他动物引起的高死亡率的急性传染病，是严重危害我国养猪业的重大疫病之一。PRV是双链线状DNA病毒，基因组大约150kb，含有特异的UL和US区域、末端重复序列和内部重复序列。

PRV能够感染哺乳动物(包括反刍动物、肉食动物和啮齿类)，但是猪是唯一能够潜伏携带该病毒的动物。感染了PRV的猪体，其临床表现和死亡亚临床症状不同：PRV感染对新出生的小猪和其他易危物种都是致死的，并且是死于中枢神经系统疾病；相反地，年长的猪体发展成为主要的呼吸系统症状；跟α-疱疹病毒一样，PRV通常在宿主的周围神经系统建立终身潜伏感染，当潜伏的病毒基因组自发或者通过应激和病毒出芽触发而被再次激活，潜伏感染的动物将成为再次感染的源头；PRV感染怀孕的母猪后可能会导致生殖障碍，比如流产或者死胎。

从2011年以来，国内许多免疫了Bartha-K61的猪群出现了PRV新的变种，免疫和攻毒实验结果表明传统的Bartha-K61疫苗株已不再能够对当前的PRV变种提供完全保护。

发明内容

发明人对变种分离株与之前的包括Bartha-K61在内的PRV毒株基因组进行比对和分析，发现大多数的病毒蛋白出现了基因替换、插入或缺失，这暗示着当前的PRV流行分离株发生了变异。当前，市场急切需要基于现有流行毒株开发的PRV疫苗。

为了解决当前市场缺乏伪狂犬病病毒变异株疫苗不足的现状，本发明的目的之一是提供一株与当前流行变异株同源性很高，能代表当前流行变异特点，与猪伪狂犬病病毒经典株差异明显的强毒株。该毒株可作为基因改造的亲本毒株，为开发针对流行毒株的PRV疫苗提供亲本材料。

本发明的亲本毒株猪伪狂犬病毒PRV HNxy是2016年从中国河南信阳某猪场免疫Bartha-K61疫苗后发病的猪脑组织中分离得到的。该毒株与当前流行的猪伪狂犬病病毒变异株同源性很高，但是与猪伪狂犬病病毒经典株差异明显，gE基因第316位氨基酸为苏氨酸，在第48位和494位氨基酸分别突变插入一个天冬氨酸。动物实验结果表明，PRV HNxy株对小鼠和仔猪都表现出强致死性；仔猪感染PRV HNxy株后，出现猪伪狂犬病典型症状。

该猪伪狂犬病毒PRV HNxy已于2019年05越29日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)保藏，包保藏编号为CGMCCNo.17696。

本发明的另一个目的是提供一株基于上述猪伪狂犬病毒PRV HNxy经基因工程方法构建的缺失gI、gE、US9和US2基因的猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株。该毒株为针对当前流行的猪伪狂犬病病毒强毒株变异株的弱毒株，可用于制备PRV疫苗。

本发明的猪伪狂犬病病毒变异株基因缺失毒株是以猪伪狂犬病病毒变异株HNxy为出发毒株，使其gI、gE、US9和US2蛋白失活获得的减毒株。其中，所述gI基因序列如序列表中序列1所示；所述gE基因序列如序列表中序列2所示；所述US9基因序列如序列表中序列3所示；所述US2基因序列如序列表中序列4所示。