[发明专利]一种检测DNA中的单链断裂的方法

说明书

本发明公开了一种检测DNA中的单链断裂的方法，包括如下步骤：1)对待测DNA进行片段化，由此产生的片段的3’末端不能被加尾；2)对片段化的待测DNA的3’末端进行第一次加尾；3)对第一次加尾后的样品通过以下步骤捕获和识别全基因组中DNA单链断裂(single strand breaks,SSBs)的位置：首先，使用嵌合5’‑DNA‑RNA‑3’引物对加尾后的片段进行线性扩增；其次，对扩增产物的3’末端进行第二次加尾；最后，目标产物通过包含接头序列的寡核苷酸进行PCR扩增建库并进行二代测序。4)通过测序结果确定SSBs位置。

技术领域

本发明属于生物技术领域。旨在提供一种命名为SSiNGLe-ILM(基于Illumina测序平台上核苷酸水平的单链断裂DNA检测)的方法，该方法可在Illumina新一代测序平台上绘制全基因组范围内DNA中的单链断裂(single strand breaks,SSBs)，其检测精度可达核苷酸水平。

背景技术

DNA损伤现在被普遍认为是癌症和许多其他与衰老相关疾病的主要原因，与人类健康息息相关。DNA损伤有多种类型，其中单链断裂是最为普遍的一种。这些损伤表现为氧自由基位点的DNA损伤，在切除DNA修复通路以及相关中间产物如拓扑异构酶等过程中起调节作用。SSBs引起的复制叉停滞或者崩塌可进一步恶化成更为严重的双链断裂(doublestrand breaks，DSBs)。另外，作为细胞中的一个主要问题，SSBs可以抑制RNA聚合酶催化的转录进程，甚至在一些情况下可以导致细胞凋亡。目前发现详细的SSBs修复通路，贯穿由发现到开始修复的每个步骤，体现了DNA损伤的重要性。这些细胞通路的缺陷可导致细胞对基因毒性应急反应、胚胎致死以及一系列神经退行性疾病的敏感性增强。

对SSB修复机制的详细步骤的需求与日俱增，然而，与之形成鲜明对比的是定位核苷酸层面上的、全局的、精确无偏的内源性SSBs方法的严重缺失。相比之下，一系列综合性的用于定位DSBs的方法已经较为成熟，例如BLESS、BLISS等等(参考综述)。据了解，目前只有一个方法可以找到对应的内源性SSBs，主要依靠SSB的3’-OH标记，引导DNA聚合酶I进行切口平移反应，用生物素化的核苷酸标记下游DNA。已标记的DNA经过纯化后，直接进行二代测序。然而，这个方法的主要缺点在于反应产物是一段DNA区域，很有可能从原SSB位置中延伸出去几千个碱基，从而无法精确地从核酸层面上鉴定损伤位置。另外一方面，胡教授等人研发了一种检测在全基因组水平定位切除修复过程中切除产生的初级短DNA断裂的方法，该方法能够从核酸层面上精确地找到SSB。但是无法提供由其他机制产生的SSB的信息，因此无法综合反映SSBs。

综上所述，这种非常重要的DNA损伤——SSBs，其核酸水平的全基因组图谱仍未知。在这里，我们研发并验证了一种新方法，即SSiNGLe-ILM，它可以检测核酸水平的SSBs。我们将这种方法应用在常用的Illumina测序平台上。结果表明，断裂的基因组模式——SSB“断裂组”很可能为研究生物系统状态提供新的研究维度，并且可作为血液生物标记物的一种新来源。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于核苷酸水平的单链断裂DNA检测方法，该方法可以在二代测序平台上全面地绘制全基因组范围内DNA中的单链断裂(SSB)，其检测精度可达核苷酸水平。

本发明的技术方案如下：

一种检测DNA中的单链断裂的方法，包括如下步骤：

1)对待测DNA进行片段化，由此产生的片段的3’末端不能被加尾；

2)对片段化的待测DNA的3’末端进行第一次加尾；

3)对第一次加尾后的样品通过以下步骤捕获和识别全基因组中DNA单链断裂(single strand breaks,SSBs)的位置：

首先，使用嵌合5’-DNA-RNA-3’引物对加尾后的片段进行线性扩增；