[发明专利]一种利用ARMS-PCR技术检测甲基化水平的方法及其引物和试剂盒

说明书

本发明公开了一种利用ARMS‑PCR技术检测甲基化水平的方法及其引物和试剂盒。其检测方法为：(1)提取待测样本DNA，并用亚硫酸氢盐对其进行处理；(2)利用设计的引物对步骤(1)处理后的DNA片段进行ARMS‑PCR即可。本发明针对甲基化和未甲基化的CpG位点设计ARMs引物来特异性扩增体液特异性的CpG位点，进而识别体液样本。该技术可检测CpG位点的甲基化水平，检测方法特异性高，操作简单，成本低，检测准确，识别能力高。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用ARMS-PCR技术检测甲基化水平的方法及其引物和试剂盒。

背景技术

在法医学案件现场，血液、精液、唾液、阴道分泌物以及月经血等体液是常见的物证检材。这些体液检材，不仅能用于DNA分型和个体识别，并且检材的生物学来源对案件性质的判定、案件方向的指明以及犯罪现场的重塑具有重要意义。

既往研究已经开发了多种体液识别方法，例如化学检测、免疫学检测、光谱分析和显微镜检测等。这些传统的体液检测方法特异性低，破坏并消耗检材，检测结果还容易受假阳性和假阴性结果的影响。另外，传统的体液识别方法大多是推定结果，并且一次检测仅针对一种体液，不能实现对多种体液的复合鉴定(即通过一次实验便可对多种体液进行性质鉴定)。随着分子生物学技术的发展，已经有大量的文献报道了具有体液特异性的mRNA、miRNA以及DNA甲基化等分子生物学标记，在法医学实践中具有体液鉴定的潜在价值。对于mRNA，自然环境中的RNA酶使它非常容易降解，尤其是对微量检材或者陈旧检材的影响更大。对于miRNA，它虽然是研究的热点，但其体液识别鉴定标准还不完善，在实际应用中仍存在一定的缺陷。而对于DNA甲基化，它相对稳定，不仅与个人识别相兼容，而且不会进一步损耗检材尤其是微量检材。

表观遗传是在不改变DNA序列的情况下发生的基因表达变化。在人类中，研究最广泛的表观遗传修饰就是DNA甲基化，其主要发生在胞嘧啶(C)-磷酸(p)-鸟嘌呤(G)(CpG)二核苷酸上。在人类基因组中，大约60-90％的CpG位点是被甲基化的，高频率的CpG位点区域称为CpG岛，通常与基因的调控区域相关。既往研究表明，通过全基因组分析，证实了DNA携带组织特异性的甲基化模式，并且在法医学领域已经初步得到可用于体液鉴定的组织特异性DNA甲基化标记。

因此对组织特异性差异甲基化区(tDMR，tissue-specific differentiallymethylated regions)中某些CpG位点的甲基化状态进行检测能够鉴定样本的细胞或者组织来源。同时，对DNA甲基化的检测不会消耗额外样本，并能利用DNA分子的稳定性鉴别体液类型。因此，对CpG位点甲基化检测可以克服现有方法的很多局限性，如稳定性差、微量检材和陈旧检材鉴定困难等。当然，理想的体液特异性CpG位点应该在目标体液中完全甲基化(90％)，在其他所有体液中完全未甲基化(10％)，反之亦然。

目前，已经有较多文献对组织特异性甲基化模式进行了报道。2011年Frumkin等人首次利用甲基敏感的限制酶检测DNA甲基化状态并进行法医学体液鉴定。2012年，Wasserstrom等人开发了一个用DNA甲基化来识别精斑的试剂盒(NucleixDSI-Semenkit)。2012年，Lee等人和Madi等人采用亚硫酸氢盐测序技术检测DNA甲基化水平，对精液、唾液、月经血、阴道分泌物和口腔拭子等体液检材进行了识别。2017年，Jung等人联合了7个实验室通过单碱基延伸法(SNaPshot)检测了多个CpG位点，最终构建了由7个CpG位点组成的复合扩增系统，检测并体液特异性的甲基化位点。

不过既往研究仍存在较多问题：(1)目前得到的体液特异性CpG位点很少。之前已根据芯片和测序结果筛选出了一些识别体液的CpG位点，但有效识别体液的CpG位点较少，而且特异性不高；