[发明专利]一种末端脱氧核糖核苷转移酶变体及其应用

说明书

本发明提供一种末端脱氧核糖核苷转移酶变体及其应用，通过在野生型氨基酸序列中特定位点引入突变，提高了其与3’‑OH端修饰的核苷酸的耦合效率，实现了高效可控地用于酶促反应合成核酸分子。本发明还提供一种没有模板链的情况下合成核酸分子的方法。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种末端脱氧核糖核苷转移酶变体及其应用。

背景技术

DNA是生命信息的载体，获得DNA是研究、改造和创造生命的首要步骤。DNA合成技术是生命科学领域最重要的共性基础保障性技术。现有从头合成寡核苷酸的方法主要有两种：化学合成法（固相亚磷酰胺三酯合成法）和生物合成法（酶促合成法）。在20世纪50年代起，化学法和酶促法各有发展，寡核苷酸合成的核心关键变为能可控、高效、持续合成。1981年，固相亚磷酰胺合成法被发明，该方法以多孔玻璃(controlled pore glass, CPG)或聚苯乙烯(polystyrene, PS)作为固相载体，通过脱保护、偶联、加帽和氧化四步循环反应，将带有亚磷酰胺的核苷酸单体逐个加到合成链上，由3'端→5'端延伸合成寡核苷酸，获得不断增长的寡核苷酸链。基于经典固相亚磷酰胺合成法发展出来的合成平台主要有柱式合成和芯片合成两种。到目前为止所有主要合成平台仍采用该合成方法，而这两种平台随着技术的发展都有了长足的进步。但是，化学合成法（固相亚磷酰胺三酯合成法）包括四步循环，反应步骤繁琐、单个循环耗时较长（6-8分钟）、化学试剂消耗较多且成本较高，大量使用有毒、易燃的有机试剂，污染较大。亚磷酰胺四步法中，采用三价磷的亚磷酰胺为合成单体，该价态的三价磷分子结构容易被氧化，也容易与水反应，故为了保证高偶联效率以及低的合成错误率，整个偶联反应过程需要严格的无水无氧环境，即反应过程不仅需要惰性气体保护，而且反应中使用的试剂及清洗溶剂也需要严格控制水份含量，通常试剂中的水份含量需要≤30 ppm，这也不可避免的会增加寡核苷酸合成难度以及合成成本。

由于化学合成法中脱保护步骤需要用到三氯乙酸（TCA）以去除DMT保护基供下一步缩合，当不断延伸的寡核苷酸链重复暴露于此质子酸时，会导致脱氧腺苷和脱氧鸟苷的脱嘌呤残基等副反应的发生，从而导致错误率的升高。除脱嘌呤以外，另一个与酸脱DMT保护基相关的问题是DMT碳正离子的可逆形成。为了完全去除DMT基团，必须将该碳正离子从固相载体表面冲洗掉。否则，由于残余碳正离子引起的脱氧核苷酸5’-羟基的再保护会导致一系列失败序列的产生，其在每个合成循环中会继续延伸。由于以上因素的影响，化学法合成寡核苷酸存在合成长度短，较长链片段错误率高等问题。

因此，如何采用生物酶实现寡核苷酸的可控合成，逐渐成为大家研究的重点。随着DNA测序的发展，过去用于测序的带修饰阻断基团的核苷酸，越来越多的被用于酶促寡核苷酸合成，可实现每次反应只掺入一个核苷酸。近年来，发展了多种方法，采用在不同位点修饰化学基团的核苷酸单体，达到掺入一个核苷酸即终止反应的效果，达到可控的合成寡核苷酸的目的。目前，酶促寡核苷酸的合成主要有两种方法：（1）采用3'-OH端加入阻断基团的核苷酸为底物，酶促反应只能催化一个带修饰基团的核苷酸掺入，随后采用化学或生物方法除去修饰基团，使3'端重新恢复为OH；（2）在核苷酸的其余位点加入阻断基团，同样每次酶促反应只能催化一个带修饰的核苷酸，随后需要去阻断，使催化反应继续。但现有DNA聚合酶活性低，如何实现高效可控酶促寡核苷酸仍是一大难题。

发明内容

本发明提供一种末端脱氧核糖核苷转移酶变体，可以在不依赖模板的情况下实现高效的催化活性，可显著提高其与3’-OH端经修饰的核苷酸的耦合效率，实现可控的核苷酸链合成。

本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种末端脱氧核糖核苷转移酶(TDT)变体，包含D396或K403中至少一个位置发生如下突变：D396E或K403M，即与SEQ ID NO:1比对，在对应于SEQ IDNO:1第396位置的天冬氨酸被谷氨酸取代，或对应于SEQ ID NO:1第403位置的赖氨酸被甲硫氨酸取代。