[发明专利]一种基于双激发比率型上转换荧光探针的胞内检测方法

说明书

本发明属于纳米生物材料技术领域，公开一种基于双激发比率型上转换荧光探针的胞内检测方法。该方法包括将纳米探针与待测目标物在细胞内接触反应，采用双激发光，通过监测纳米探针发光强度来检测待测目标物的浓度；纳米探针为染料敏化稀土掺杂上转换纳米颗粒；待测目标物选自细胞内与众多生理和病理有关活性氧、活性氮，或者细胞内的金属离子。该方法利用染料高效敏化上转换纳米颗粒的能量传递过程，提高检测的灵敏度；提供双激发比率探针模型，作为设置参比，减少因为细胞内复杂环境、探针分布、仪器设备引起的检测偏差；提供近红外双激发共聚焦显微镜系统的设计方案，为检测细胞内物质提供新思路。

技术领域

本发明属于纳米生物材料技术领域，尤其是涉及一种基于双激发比率型上转换荧光探针的胞内检测方法。

背景技术

发展非入侵性荧光探针，监测活细胞内的生物分子或生理过程，对了解细胞生物学、病理学和其他生物医学相关科学至关重要。然而，当前胞内分析主要通过靶向成像或非定量荧光标记，不能达到实际需求。其中的一个原因是探针的灵敏度低。例如，细胞里次氯酸浓度很低，如果没有外界的刺激，一般探针很难检测到内源性次氯酸。虽然一些染料探针的体外检测限也可以达到很低，但是它们水溶性差、发射波长短，限制了其在细胞检测中的应用。另一方面，这些染料探针在细胞中单波长检测，无法提供内置校准以校正各种与分析物无关的因素，例如仪器效率、样品微环境和探针分子的局部浓度，因此无法实现精确和定量特定分析物。

稀土掺杂上转换荧光标记材料(UCNPs)具有近红外激发、无荧光背景、穿透深度深、低毒性和较小的光损伤等优点，是一种理想的生物标记材料。但上转换材料发光效率低，检测灵敏度低，制约其实际应用。由于染料分子吸收峰宽、吸收截面大，可以作为“天线分子”，吸收近红外光再将能量传递给稀土离子，可以大大提高上转换纳米颗粒的发光效率。2012年，荷兰的Hummelen课题组利用染料IR-806敏化稀土掺杂纳米晶，使得720-1000nm处总的上转换发光效率提高了3300倍。这种从有机染料到UCNPs有效能量传递为细胞内灵敏检测提供了新方法。最近，刘志宏课题组设计的近红外染料敏化NaYF₄:Yb,Er@NaYF₄:Nd探针，信背比达到30倍，可灵敏监测细胞内的谷胱甘肽。但是，目前染料敏化上转换纳米颗粒探针还不能对细胞内物质进行比率定量检测。除此之外，传统的共聚焦显微镜不能实现双激发，限制了近红外染料敏化上转换纳米颗粒的胞内比率型检测。

发明内容

为了解决现有技术中染料敏化上转换纳米探针无法实现精确胞内定量检测的问题，本发明提供了一种基于双激发比率型上转换荧光探针的胞内检测方法。

一种基于纳米探针的胞内检测方法，该方法包括将纳米探针与待测目标物在细胞内接触反应，采用双激发光，通过监测纳米探针发光强度来检测待测目标物的浓度；

所述纳米探针为染料敏化稀土掺杂上转换纳米颗粒；

所述待测目标物选自细胞内与众多生理和病理有关活性氧、活性氮，或者细胞内的金属离子。

根据本发明的技术方案，所述双激发光由两个独立的光源产生，光源一产生的上转换光强度与待测目标物浓度呈线性关系，而光源二产生的上转换光不受待测目标物浓度的影响，作为内置参比。

根据本发明的技术方案，所述活性氧和活性氮可以为次氯酸根(ClO^-)、超氧阴离子自由基(O2^·-)、过氧化亚硝酸离子(ONOO^-)、一氧化氮(NO)、过氧化氢(H₂O₂)和羟基自由基(·OH)等中的至少一种，例如可以为ClO^-、O2^·或·OH；示例性地，所述活性氧为ClO^-。