[发明专利]培养基及骨髓间充质干细胞的成骨诱导方法

说明书

本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及培养基及骨髓间充质干细胞的成骨诱导方法。以本发明提供的培养液培养骨髓间充质干细胞，细胞生长迅速，培养至2～3天细胞克隆形成，8d后，细胞可长满皿底并呈现单层细胞融合。以本发明提供的培养液诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化，细胞生长迅速2～3天细胞长满皿底，骨钙素含量较高。传代并诱导至第8代均生长开始明显变缓，10代以后细胞内开始出现颗粒样沉积物，并有细胞脱落飘浮于液体中。

技术领域

本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及培养基及骨髓间充质干细胞的成骨诱导方法。

背景技术

骨髓间充质干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是存在于骨髓组织中的一类具有自我更新、增殖能力强，及多向分化能力的间充质干细胞。骨髓干细胞的可以分化成各种间充质来源的细胞，如成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、肝细胞、肌细胞、神经细胞等，是未来干细胞在医疗应用上具有巨大潜力的理想种子细胞。

研究间充质干细胞成骨分化对骨组织工程的发展具有重要意义，骨组织工程的研究大多趋向于采用骨髓间充质干细胞作为种子细胞。成人骨髓间充质干细胞采集数量有限，故一般需在体外培养扩增20余天才能达到满足组织工程所需的细胞数量。这很大的限制了组织工程在临床的应用。因此解决细胞快速扩增的问题是目前骨组织工程临床应用的关键之一。

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种糖蛋白，含有174个氨基酸，分子量约为20000。G-CSF主要作用于中性粒细胞系(lineage)造血细胞的增殖、分化和活化。重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能。

表皮细胞生长因子(EGF)，又名人寡肽-1，是人体内的一种活性物质，由53个氨基组成的活性多肽，藉由刺激表皮细胞生长因子受体之酪氨酸磷酸化，达到修补增生肌肤表层细胞，据说对受伤、受损之表皮肌肤拥有绝佳之疗效。其最大特点是能够促进细胞的增殖分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。EGF还能止血，并具有加速皮肤和粘膜创伤愈合，消炎镇痛，防止溃疡的功效。EGF的稳定性能极好，在常温下不易失散流动，能与人体内各种酶形成良好的协调效应。最初的EGF主要被运用于医学领域，主要用于促进受损表皮的修复与再生，如治疗烧伤、烫伤等。

氨甲环酸，英文名称：Tranexamic Acid，化学名称：对氨甲基环己烷甲酸、反式－4－氨甲基－环己烷甲酸。可抑制这种纤溶酶的作用，而显示止血、抗变态反应、消炎效果。主要用于急性或慢性、局限性或全身性纤维蛋白溶解亢进所致的各种出血。

目前，尚未见将氨甲环酸、G-CSF和EGF用于促进骨髓间充质干细胞的增殖或分化。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供培养基及骨髓间充质干细胞的成骨诱导方法，该培养液诱导效率较高，所得细胞骨钙素含量较高。

本发明提供的培养基A，由基础培养基、氨甲环酸、G-CSF和EGF组成。

本发明提供的培养基A中：所述氨甲环酸的浓度为200mg/ml；所述EGF的浓度为10～20ng/ml；所述G-CSF的浓度为10～20ng/ml。

本发明提供的培养基A中，还包括；所述青霉素的浓度为100U/mL；所述链霉素的浓度为100U/mL。

一些实施例中，本发明提供的培养基A由：基础培养基、200mg/ml氨甲环酸、10～20ng/ml EGF、10～20ng/ml G-CSF、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。

一些具体实施例中，本发明提供的培养基A由：基础培养基、200mg/ml氨甲环酸、20ng/ml EGF、20ng/ml G-CSF、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素。