[发明专利]间充质干细胞包装腺病毒系统的建立方法及应用

说明书

本发明建立了间充质干细胞包装腺病毒系统的建立方法及应用，属于基因治疗领域。本发明中对用作载体的MSC细胞进行改造获得稳定表达E1基因的MSC‑E1细胞系。再将具有杀伤肿瘤细胞作用的复制缺陷型腺病毒感染这种细胞系，通过细胞内组装，制备一种能够包装并复制腺病毒的细胞系统，将该细胞系统对肿瘤模型小鼠进行尾静脉注射，达到极好的杀伤小鼠肿瘤块的目的。本发明所建立的系统可以解决肿瘤基因治疗中的三大瓶颈，1)使生物治疗剂免除宿主防御机制的攻击；2)使生物治疗剂特异性的到达肿瘤部位；3)使治疗基因在肿瘤组织内高效表达。

技术领域

本发明涉及病毒载体的构建，MSC细胞的克隆基因E1体外转染，以及重组腺病毒感染MSC细胞，并应用于乳腺癌的治疗，属于基因治疗领域。

背景技术

基因治疗的手段是将抑癌基因用某种载体导入到肿瘤细胞中，使其表达并执行对肿瘤细胞的杀伤作用。目前众多的抑癌基因已被发现，病毒载体以其高效性广泛应用于科研及临床实践，80％以上使用腺病毒和逆转录病毒。逆转录病毒能够整合到宿主基因组，因此可能产生插入突变，而造成安全性的问题。而腺病毒可以高效表达目的基因，且不整合到宿主基因组中，故使用更安全，更有发展前景。某些治疗性的抑癌基因，比如p53，p14已经应用于临床生物治疗。虽然能够抑制肿瘤生长的候选基因很多，但是肿瘤基因治疗的实际效果仍不很理想，这主要有三个重要的瓶颈需要克服：一是要解决生物治疗剂怎样免除宿主防御机制的攻击，二是要解决生物治疗剂怎样特异性的到达肿瘤部位，三是要让治疗基因怎样在肿瘤组织内高效表达。当前腺病毒载体介导基因转移，以其高转染效率成为目前基因治疗中经常采用的方法，但这种方法无法解决靶向性的问题，而且裸病毒有很强的免疫原性，所以只能局限于对表层实体肿瘤的局部注射，而不能用于治疗深层肿瘤和肿瘤的扩散。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)由Friedenstein等在1968年首先发现，是一种存在于骨髓与其他组织间质内的非造血系成体干细胞，具有自我更新、增殖及多向分化的潜能，在体外能够贴壁培养并大量扩增，在特定的诱导条件下能够分化为中胚层的脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞等组成。间充质干细胞是是骨髓微环境的重要组成部分,能够分泌许多因子,包括SCF、IL26、IL27、IL28、IL211、IL212、IL214、IL215和白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF),在体内和体外均具有支持和调控造血的作用。MSC具有独特的免疫表型和免疫调节能力,已有的研究显示MSC不表达MHC2Ⅱ类分子和FasL,不表达或极低水平表达MHC2Ⅰ分子,也不表达共刺激分子如CD80、CD86、CD40和CD40L，在体内和体外均表现出较强的免疫抑制作用。因此，MSC被广泛应用于干细胞移植、组织工程和器官移植免疫治疗等方面。

肿瘤微环境对维持肿瘤的生长和进展起着重要的作用。肿瘤微环境包含有各种基质细胞：血管内皮细胞，成纤维细和炎性细胞等。许多报道表明这些细胞均来源于骨髓细胞，特别是骨髓来源的间充质干细胞有很强的嗜肿瘤特性，且具有多项分化潜能，因此MSC在肿瘤微环境的形成过程中起非常重要的作用。肿瘤生长过程中可通过自分泌或旁分泌等方式产生多种可溶性因子，趋化骨髓来源的MSC向肿瘤的靶向迁移，而不同组织来源的MSC对不同的肿瘤可能由不同的分子信号途径所介导。

发明内容

本发明的目的在于解决上述三大瓶颈，其技术原理在于：(1)间充质干细胞具有嗜瘤性，用稳定表达E1基因的间充质干细胞包裹缺失E1基因的腺病毒，可以包装出具有复制能力的腺病毒并将腺病毒特异性到达肿瘤部位产生作用。(2)间充质干细胞缺乏免疫原性，用其包裹重组腺病毒可以解决裸露病毒被宿主防御机制攻击的问题。(3)由于体外操作时初始毒种缺失E1基因，不能在体外自主复制，极大的提高了操作的安全性。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：