[发明专利]间充质干细胞包装腺病毒系统的建立方法及应用在审
| 申请号： | 201910825986.9 | 申请日： | 2019-09-03 |
| 公开（公告）号： | CN110499298A | 公开（公告）日： | 2019-11-26 |
| 发明（设计）人： | 黄映辉;张霖;马羚 | 申请（专利权）人： | 黄映辉 |
| 主分类号： | C12N7/01 | 分类号： | C12N7/01;C12N5/10;A61K48/00;A61P35/00 |
| 代理公司： | 11203 北京思海天达知识产权代理有限公司 | 代理人： | 刘萍<国际申请>=<国际公布>=<进入国 |
| 地址： | 100124 北京*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 生物治疗剂 细胞系统 小鼠 复制缺陷型腺病毒 基因治疗领域 间充质干细胞 杀伤肿瘤细胞 宿主防御机制 肿瘤基因治疗 复制腺病毒 尾静脉注射 高效表达 稳定表达 治疗基因 肿瘤部位 肿瘤模型 肿瘤组织 腺病毒 杀伤 制备 组装 肿瘤 瓶颈 细胞 感染 攻击 应用 改造 | ||
1.一种使用间充质干细胞包装重组腺病毒的方法，其特征在于，包括：
(1)用慢病毒系统改造MSC细胞，获得稳定表达腺病毒E1基因的MSC-E1细胞系；
(2)用缺失E1基因的腺病毒AdGFP感染MSC-E1细胞系，以获得可复制的腺病毒AdGFP。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(1)具体为：构建pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-E1质粒，与腺病毒骨架质粒共转染MSC细胞。
3.如权利要求2所述方法，其特征在于，步骤(1)具体为：
1)选取腺病毒基因组上的560bp至3509bp，首尾添加XbaⅠ和NotⅠ的酶切位点，进行全序列合成；
2)用XbaⅠ和NotⅠ酶对pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro质粒进行酶切，并用琼脂糖分离并切胶回收线性化的载体；
3)用T4连接酶将合成的E1基因和线性化载体连接并转入DH5α感受态细胞中，并于带有氨苄抗性的LB培养基中筛选出单克隆进行一代测序，保存测序结果符合要求的菌种，构建成功的质粒命名为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-E1；
4)将pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-E1质粒与慢病毒骨架质粒共转染MSC细胞并用嘌呤霉素筛选转染后的MCS细胞，得到稳定表达的MSC-E1细胞系。
4.如权利要求1所述方法，其特征在于，用缺失E1基因的AdGFP腺病毒在含有2％血清的DMEM高糖培养基培养环境下，2％血清指血清和培养基的体积比，以MOI＝5感染MSC-E1细胞。
5.如权利要求1所述方法，其特征在于，还包括：
将步骤(2)中的细胞消化下来，对构建了肿瘤模型的小鼠进行尾静脉注射；
(1)每只裸鼠乳房垫注射1×106N2O2-H2BGFP细胞悬液；
(2)2-3周后在小鼠尾静脉注射100μl浓度为1×107/ml的包装有缺失E1基因的AdGFP腺病毒的MSC-E1细胞悬液。
6.权利要求1所制备的间充质干细胞包装腺病毒的系统，用于治疗恶性肿瘤的腺病毒的药物。
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