[发明专利]一种根癌农杆菌介导的桃熏草莓遗传转化方法

权利要求书

1.一种根癌农杆菌介导的桃熏草莓遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)桃熏草莓匍匐茎茎尖经无菌清洗后剖取茎尖生长点0.2-0.3mm，接种于由MS+细胞分裂素苄氨基嘌呤0.5mg/L+赤霉素0.2mg/L+3％蔗糖组成的茎尖诱导培养基MS1中培养，待成苗后转至由MS+生长素吲哚丁酸0.01mg/L+细胞分裂素苄氨基嘌呤0.3mg/L+3％蔗糖组成的组培苗继代培养基MS2中进行继代，每隔30-40d继代一次；

(2)以所述桃熏草莓组培苗叶龄32-36天的桃熏叶片为受体材料，去掉叶缘和主叶叶脉，剪成0.3-0.5cm²小块，正面朝下置于由MS+生长素吲哚丁酸0.1mg/L+细胞分裂素噻苯隆2.8mg/L组成的不定芽诱导培养基上进行预培养1-7天，得预培叶片；

(3)配制根癌农杆菌溶液：用20μL无菌带枪头移液器挑取-80℃保存的根癌农杆菌GV3101，在由LB+卡那霉素50mg/L+庆大霉素50mg/L+利福平50mg/L组成的固体培养基上划线培养，28℃，12-48h，长出单菌落；无菌枪头挑取单菌落，划线保存，同时用该枪头接种于由5mlLB+卡那霉素50mg/L+庆大霉素50mg/L+利福平50mg/L组成的液体培养基中，28℃，200rpm过夜培养；取10μL培养的菌液于20ml相同培养基中扩繁，28℃，200rpm，培养至OD₆₀₀＝0.4-0.6；25℃，5000rpm，离心5min收集GV3101菌体，用含20mg/L乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬收集的菌体至OD₆₀₀＝0.5；

(4)所述预培叶片置于OD₆₀₀＝0.5的根癌农杆菌溶液中，轻轻摇晃5min后倒掉菌液，换新的菌液继续摇晃5min浸染叶片，再置于无菌滤纸上晾干菌液，叶片近轴面向下放置于由MS+细胞分裂素噻苯隆2.8mg/L+生长素吲哚丁酸0.1mg/L+乙酰丁香酮20mg/L组成的培养基中进行共培养至肉眼可见，得初始转化材料；

(5)共培养后的初始转化材料置于含羧苄青霉素500mg/L+特美汀500mg/L的MS液体培养基中1h，过程中不断晃动，后置于无菌滤纸上晾干，接于由MS+细胞分裂素噻苯隆2.8mg/L+生长素吲哚丁酸0.1mg/L+Cef 250mg/L+羧苄青霉素250mg/L组成的延迟选择培养基中培养3-5d；延迟筛选后的叶片置于由MS+细胞分裂素噻苯隆2.8mg/L+生长素吲哚丁酸0.1mg/L+Cef 250mg/L+羧苄青霉素250mg/L+Hyg 5mg/L组成的筛选培养基进行筛选培养，两周继代一次，得转化桃熏草莓芽苗；

(6)荧光检测和PCR鉴定；

所述桃熏草莓是十倍体桃熏草莓；

所述根癌农杆菌的菌种为根癌农杆菌GV3101；

转化共培养的转化载体为载体pCambia1300-35s-GFP，其部分DNA序列如SEQ ID NO.1所示。