[发明专利]基于玻璃纳米电极的单细胞糖基新陈代谢标记方法

说明书

本发明提供一种基于玻璃纳米电极的单细胞糖基新陈代谢标记方法，包括如下步骤：(1)将含叠氮基或炔基的糖注入玻璃纳米管；(2)工作电极选定细胞后使用倒置显微镜通过微操对纳米管进行调整至纳米管尖端插入细胞，通过成像系统对于这一过程进行观察，并施加200‑800mV的直流电压，通电2‑8min将所述含叠氮基或炔基的糖注入细胞质内；(3)通过叠氮/炔键反应生成正交荧光团标记。本发明提供了一种高精确性单细胞表面的聚糖标记的成像检测，将时间大大缩短，提高了检测的特异性和灵敏度，并且采用纳米电极标记技术减少了非自然糖的实验用量且在操作得当下可进行重复实验。

技术领域

本发明涉及细胞活体成像分析技术，具体地说，涉及基于玻璃纳米电极的单细胞糖基新陈代谢标记方法。

背景技术

近年来，研究表明细胞表面聚糖的表达可以为阐明其如结构组成、细胞识别、疾病发生等方面的生物功能作用及其对人类疾病的影响提供有价值的信息。随着使用代谢标记检测细胞表面聚糖这一方法的蓬勃发展，其解决了利用从植物或动物中提取的凝集素对于糖类的识别时选择性差的缺点，大大提高了特异性和成像效果。

所有细胞的表面都装饰着密集的糖链。单糖作为各种糖缀合物的前体，被细胞摄取以构建各种糖基结构。单细胞表面膜聚糖的监测和调控能力在糖生物学、细胞生物学和病理学中发挥着重要作用。因此我们使用了人工糖进行代谢标记，然而，由于代谢标记需要使用非天然糖，这些人工糖通常不加区分地进入细胞，导致大量细胞中聚糖的全局标记。这一限制否定了在单细胞水平上研究聚糖表达谱的能力。研究表面上相同细胞的聚糖表达多样性，对于提高我们在单细胞水平上对遗传异质性的理解至关重要。目前，单细胞技术，特别是单细胞成像技术的发展取得了重大进展。纳米线、纳米管、纳米电极等纳米尺度器件由于具有较高的时空分辨率，在单细胞研究中显示出巨大的应用前景。值得注意的是，插入基于玻璃纳米管的无损装置可以分析单个活细胞中的特定分子。纳米管制备方便，使用方便。纳米管具有超小的尖端面积(直径小于100纳米)，为精确定位和运输单个活细胞提供了良好的工具，且损伤小。

目前，多种检测细胞表面聚糖的方法已被提出。其中传统检测方法是通过体外内吞作用从而进行表达，时间长且选择性差，无法实现单细胞的研究分析。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种可快速检测单个细胞表面聚糖的基于玻璃纳米电极的单细胞糖基新陈代谢标记方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种基于玻璃纳米电极的单细胞糖基新陈代谢标记方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将含叠氮基或炔基的糖注入玻璃纳米管；

(2)纳米管中有一个电极作为工作电极插入充满细胞的溶液中，另一个电极作为参比电极浸入培养基中，工作电极选定细胞后使用倒置显微镜通过微操对纳米管进行调整至纳米管尖端插入细胞，通过成像系统对于这一过程进行观察，并施加200-800mV的直流电压，通电2-8min将所述含叠氮基或炔基的糖注入细胞质内；

(3)将步骤(2)选定的细胞放回培养箱中继续孵育使所述含叠氮基或炔基的糖在细胞表面表达后，加入带有炔基或叠氮基的荧光染料继续孵育，使带有炔基的荧光染料与细胞表面含叠氮基的糖结合，或者带有叠氮基的荧光染料与细胞表面含炔基的糖结合，随后用细胞培养液冲洗，使用荧光成像技术对于单细胞进行原位标记成像。

作为一个优选方案，所述纳米管的孔径为50-100nm。

作为一个优选方案，步骤(1)中采用离心方法将含叠氮基或炔基的糖注入玻璃纳米管，离心时的参数优选为3000rpm，3min。

作为一个优选方案，步骤(2)施加400mV的直流电压，通电5min将所述含叠氮基或炔基的糖注入细胞质内。

作为一个优选方案，步骤(3)中将选定的细胞放回培养箱中继续孵育6-15h使所述含叠氮基或炔基的糖在细胞表面表达后，加入带有炔基或叠氮基的荧光染料继续孵育30-40min。