[发明专利]一种草铵膦脱氢酶突变体及在氧化-还原多酶偶联生产L-草铵膦中的应用

说明书

本发明公开了一种草铵膦脱氢酶突变体及在氧化‑还原多酶偶联生产L‑草铵膦中的应用，该方法利用D‑氨基酸氧化酶制备L‑草铵膦前体的方法，以D,L‑草铵膦或D‑草铵膦为底物，在有氧环境及过氧化氢酶存在的情况下，利用离体的D‑氨基酸氧化酶或体外表达D‑氨基酸氧化酶的细胞催化D‑草铵膦得到2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸；2‑羰基‑4‑[羟基(甲基)膦酰基]丁酸再在草铵膦脱氢酶的作用下，催化生成L‑草铵膦，催化剂的活性提高了近10倍，底物浓度提高了5倍，该方法原料转化率高、收率高、产物易于分离提纯。

(一)技术领域

本发明涉及生物化工领域，涉及一种手性纯L-草铵膦的生产方法；是一种利用来源于微生物的氨基酸氧化酶和草铵膦脱氢酶偶联生产光学纯L-草铵膦的方法。

(二)技术背景

草铵膦(glufosinate-ammonium)是世界第二大转基因作物耐受除草剂，由赫斯特公司(几经合并后现归属拜耳公司)开发生产，化学名称为4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸，又称草铵膦铵盐、Basta、Buster等，属膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成酶抑制剂，非选择性(灭生性)触杀型除草剂。

目前，世界上的三大除草剂品种是草甘膦、草铵膦和百草枯，相对于百草枯和草甘膦，草铵膦具有优异的除草性能及较小的药害副作用，随着抗草铵膦转基因作物的快速发展，草铵膦在未来一段时间内市场需求巨大，前景非常广阔。

草铵膦有两种光学异构体，分别为L-草铵膦和D-草铵膦。但只有L-型具有生理活性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性较小，除草谱广，对环境的破坏力小。

草铵膦有D、L两种对映异构体，但只有L-构型具有植物毒性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性小，对环境的破坏力小。目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。如果草铵膦产品能以L-构型的光学纯异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50％，这对于提高原子经济性、降低成本、减轻环境压力都具有十分重要的意义。目前报道的L-草铵膦的方法主要有化学合成法，包括消旋草铵膦的拆分、手性原料法、手性辅基法和不对称催化法，但存在D-草铵膦不易消旋再利用、合成步骤冗长，反应需要超低温，产物ee值较低，收率低，且手性拆分试剂价格昂贵等问题。相比之下，生物合成法具有立体选择性严格、反应条件温和及产物易分离纯化的优点，因此探索生物法生产L-草铵膦的可行性具有十分重要的产业价值和显著的社会效益。

生物法生产L-草铵膦以起始原料和途径进行分类，主要包括以下3大类：

1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得，主要的优点转化率高，产物ee值较高，但需要昂贵且不易获得的手性原料作为前体(Organophosphorus analoguesand derivatives or the natural L-amino carboxylic acids andpeptides.I.Enzymatic synthesis or D-,DL-,andL-phosphinothricinandtheircyclicanalogues[J].Bullchemsocjpn,1988,61(10):3699-3704.)。例如生物法制备L-草铵膦最简单的方法就是利用蛋白酶直接水解双丙氨膦。双丙氨膦是一种天然的三肽化合物，在蛋白酶的催化下，双丙氨膦脱去2分子L-丙氨酸，生成L-草铵膦。