[发明专利]一种草铵膦脱氢酶突变体及在氧化-还原多酶偶联生产L-草铵膦中的应用

权利要求书

1.一种草铵膦脱氢酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第164位进行单突变获得的。

2.如权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体，其特征在于所述突变体是将第164位丙氨酸突变为甘氨酸获得的。

3.一种权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体的编码基因。

4.一种权利要求3所述含草铵膦脱氢酶突变体编码基因的工程菌。

5.一种权利要求1所述草铵膦脱氢酶突变体在氧化-还原多酶偶联生产L-草铵膦中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以D-氨基酸氧化酶基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的粗酶液以及草铵膦脱氢酶突变体基因工程菌诱导培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的粗酶液为催化剂，以D-草铵膦为底物，加入过氧化氢酶、无机氨基供体和辅助底物，以pH值为7-8缓冲液为反应介质构成反应体系，在35℃-40℃、500-600rpm条件下反应，反应完全，将反应液分离纯化，获得L-草铵膦；所述辅助底物为葡萄糖、甲酸铵或异丙醇；所述无机氨基供体为甲酸铵、硫酸铵；所述草铵膦脱氢酶突变体基因工程菌是将草铵膦脱氢酶突变体基因分别与葡萄糖脱氢酶基因、醇脱氢酶基因或甲酸脱氢酶基因中的一种共同导入宿主菌构建而成。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述反应体系中，催化剂的用量以湿菌体总重量计为20～100g/L，其中D-氨基酸氧化酶基因工程菌湿菌体与草铵膦脱氢酶突变体基因工程菌湿菌体重量比为1-5：1，所述底物的初始浓度为10～500mM，辅助底物添加量为12-750mM，无机氨基供体添加量为50mM-1.5M。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述葡萄糖脱氢酶基因核苷酸序列为SEQ IDNO.3所示，所述醇脱氢酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，所述甲酸脱氢酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述草铵膦脱氢酶突变体工程菌湿菌体按如下方法制备：将草铵膦脱氢酶突变体工程菌接种至含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有50μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6-0.8，加入终浓度为24μg/mL的IPTG，18℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，用pH7.5、20mM磷酸盐缓冲液洗涤两次，获得湿菌体；将湿菌体加入pH 7.5、100mM的PBS中重悬，在冰水混合物上超声破碎10min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s，暂停5s，获得粗酶液。

10.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述D-氨基酸氧化酶工程菌湿菌体按如下方法制备：将D-氨基酸氧化酶基因工程菌接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD₆₀₀达0.6-0.8，加入终浓度为24μg/mL的IPTG，28℃下诱导培养16h后，4℃、8000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20mM磷酸盐缓冲液洗涤两次，获得湿菌体；将湿菌体加入pH 7.5、100mM的PBS中重悬，在冰水混合物上超声破碎10min，超声破碎条件：功率为400W，破碎1s，暂停5s，获得粗酶液；所述D-氨基酸氧化酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示。