[发明专利]一种动物毛发皮质醇检测的预处理方法

说明书

本发明公开了一种用于检测动物毛发皮质醇的预处理方法，尤其适用于野生动物毛发中皮质醇提取的预处理方法，包括以下步骤：步骤一：获得毛发样品；步骤二：清洁毛发并去角质化；步骤三：利用液氮磨碎清洁并去角质化后的毛发；步骤四：萃取步骤三中磨碎的毛发；步骤五：离心，取上清，干燥萃取液所得的溶质加入磷酸缓冲盐溶液。本发明提高实验效率、质量和稳定性，并节约了样品的使用量。

技术领域

本发明属于动物保护及兽医领域，涉及一种动物毛发中皮质醇检测的预处理方法。

背景技术

野生动物环境压力、应激研究可以通过体内皮质醇含量进行判断。此前使用的血液检测对动物个体影响较大，不利于动物保护和实验的准确性。毛发和粪便都属于非损伤取样，通过检测毛发中的皮质醇含量判断动物压力情况对于野生动物环境压力、应激研究是十分重要的。

由于野生动物毛发难以收集，并受自身分泌物和环境中尘土、雨水等影响，采样时无法避免污染，尽量减弱污染带来的影响，提高萃取效率及避免实验过程高温对样品的影响是从毛发中萃取皮质醇实验方案中重要的部分。

虽然目前的技术随着各种仪器的出现不断完善，但是在实验方案方面依旧存在一些问题。包括但不限于因有些毛发较长必须进行预剪切导致的无法避免的局部高温，为了减少实验时间清洗后对毛发进行加热烘干和加热萃取对样品造成的影响。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种快速准确，成本低廉/省时高效的毛发皮质醇提取方法，以推动科学领域相关研究。

本发明提供了一种动物毛发皮质醇检测的预处理方法，包括以下步骤：

步骤一：获得毛发样品；

步骤二：清洁毛发并去角质化；

步骤三：利用液氮冷冻，在研钵中磨碎清洁并去角质化后的毛发；

步骤四：萃取步骤三中磨碎的毛发；

步骤五：离心，取上清，干燥萃取液所得的溶质并加入磷酸缓冲盐溶液。

步骤一中，采用非损伤方式获得动物毛发样品，如脱落毛发，捕捉、救护等时剪取少量毛发。由于非损伤取样可获得的毛发样品量有限，且所获得的毛发可能将用于许多实验，需要尽量减少毛发样品用量。而本发明所需毛发用量少，并可以接受有一定污染的毛发。其中，所述收集动物脱落毛发不少于50mg。

步骤二中，先使用蒸馏水进行毛发的清洗，后使用异丙醇进行去角质化。由于野生动物生存环境中容易接触到泥土，首先使用蒸馏水进行清洗，洗去表面杂质后，使毛发样品得到彻底清洁，而保持毛发本身不发生其它化学反应；再使用异丙醇去角质化能够更好地起到效果，得到的结果也会更准确。

步骤二中，本发明去角质化后的毛发在室温下进行干燥，避免温度过高影响毛发稳定。

步骤三中，不使用剪刀剪碎毛发而是经过液氮冷冻后直接利用简单易得的研钵进行研磨，防止室温研磨或剪碎过程中的局部高温影响实验结果。

步骤四中，所述萃取的具体步骤为：使用无水甲醇按照每50mg毛发1ml无水甲醇的比例在室温下于旋转混匀仪上以40rpm进行24h萃取，操作简单，容易实施。

步骤五中，所述干燥在通风橱内65℃水浴中进行，通过使用通风橱和水浴锅结合替代氮吹仪，省去了利用吹氮的步骤，减少了仪器使用，提高了干燥速度，缩短了实验时间。

步骤五中，所述离心的条件为8000g、15min。

步骤五中，所述磷酸缓冲盐溶液的浓度为0.01M，即1×缓冲液。

步骤五中，所述磷酸缓冲盐溶液的pH＝7.2-7.4。