[发明专利]对有机磷具有高效降解作用的枯草芽孢杆菌及其制备方法

权利要求书

1.一株对有机磷具有高效降解作用的枯草芽孢杆菌，其特征在于：本枯草芽孢杆菌为具有降解有机磷能力的芽孢杆菌经离子束辐射诱变后培育而成，形状为杆状，细胞大小为1-1.5×1.5-4微米，无荚膜，有芽孢，经16S rDNA基因序列分析和同源性比对，确定其为枯草芽孢杆菌。

2.根据权利要求1所述的对有机磷具有高效降解作用的枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌保藏于中国工业微生物保藏管理中心甘肃分中心，保藏日期为：2018年6月20日，保藏编号为：GSMSC30266。

3.一株对有机磷具有高效降解作用的枯草芽孢杆菌的制备方法，所述枯草芽孢杆菌为权利要求1或2任一所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于：它包括以下步骤：

步骤一、出发菌株的筛选：从中国工业微生物菌种保藏管理中心甘肃分中心处获得数株具有降解有机磷能力的芽孢杆菌，分别涂布于蒙金娜有机磷固体培养基平板上，30℃下培养48h后，观察菌落周围透明圈大小，选取透明圈较大的菌株LA作为出发菌株；

步骤二、¹²C⁶⁺离子束注入诱变：将步骤一所筛选的芽孢杆菌出发菌株于液体培养基中培养至对数期，吸取1.5ml菌液至一次性培养皿中，将培养皿安装在辐照盘上；¹²C⁶⁺离子束注入LET为60KeV，辐照剂量分别为50Gy、80Gy、120Gy、150Gy、210Gy、270Gy；计算各个剂量下的菌液中菌株的存活率，绘制存活率曲线；

步骤三、突变菌株的初筛：对比不同辐照剂量¹²C⁶⁺离子束诱变处理后的菌液，将菌液的浓度稀释至10^-5、10^-6、10^-7三个梯度，并分别吸取0.1mL不同浓度的菌液添加到蒙金娜有机磷固体培养基平板上均匀涂布，倒置，培养72h；同时将未经离子束辐照诱变的菌株LA添加到蒙金娜有机磷固体培养基作为对照组，挑选出透明圈大于对照组的菌落，纯培养后保存留待复筛；

步骤四、突变株的复筛：以卵磷脂为有机磷源，将步骤三初筛选出的菌株转接至无机盐液体培养基中，30℃温度下，转速为200r/min，培养72h，离心后取发酵液10ml加入适量无磷活性炭脱色，转速为12000r/min，4℃温度下离心20min，取5mL上清液，采用钼锑钪比色法对每一瓶突变株中的速效磷进行测定，测定时分光光度计波长为680nm，以有机磷转化为速效磷的量作为复筛的依据，选出1株高效降解有机磷的芽孢杆菌突变株LA-1；

步骤五、菌株的鉴定：对步骤四所筛选出的芽孢杆菌突变株LA-1进行鉴定：

(1)形态特征鉴定：显微镜下观察，该芽孢杆菌突变株LA-1的细胞为直杆状，细胞大小为1-1.5×1.5-4微米，链状排列，无荚膜，有芽孢，能运动；在牛肉膏蛋白胨培养基上生长迅速，菌落表面粗糙，不透明，淡黄色，表面有褶皱；

(2)基于16S rDNA序列鉴定：以该芽孢杆菌突变株LA-1的基因组DNA为模板，以27F、1492R为引物对16S rDNA进行PCR扩增，将所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，送往上海生工生物工程有限公司测序，得到16S rDNA序列；将所得的16S rDNA序列在Genbank中进行同源性比较，结果该菌株与枯草芽孢杆菌属的16S rDNA同源性达到100％，说明该芽孢杆菌突变株LA-1属于枯草芽孢杆菌。

4.根据权利要求3所述的对有机磷具有高效降解作用的枯草芽孢杆菌的制备方法，其特征在于：步骤一中所述蒙金娜有机磷固体培养基中各组分的含量为：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 3g，KCl 0.3g，FeSO₄7H₂O 0.03g，MnSO₄H₂O 0.03g，MgSO₄7H₂O 0.3g，CaCO₃5g，酵母膏0.4g，蒸馏水1000mL，蒙金娜有机磷固体培养基的pH7.0-7.5。