[发明专利]一种HAO兔多克隆抗体的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种HAO兔多克隆抗体的制备方法，包括：通过原核表达得到HAO重组蛋白、将所得HAO重组蛋白制备成悬浮液，并对动物进行注射，2～4h后，对动物血清进行分离，得到HAO抗体及采用抗原亲和纯化的方法对HAO抗体进行纯化，得到多克隆抗体的过程，该方法制得的多克隆抗体特异性好，可直接对HAO蛋白进行检测。

技术领域

本发明涉及多克隆抗体制备技术领域，更具体地说是涉及一种Hydroxylamineoxidoreductase兔多克隆抗体的制备方法

背景技术

氨氧化菌是革兰氏阴性菌，归属于Proteobacteria门的β-Proteobacteria纲或γ-Proteobacteria纲，系统中氨氧化代谢过程受温度、氧量、碱度、基质浓度等宏观环境因素影响巨大，被认为是污水生物处理系统中最为敏感、脆弱的代谢途径，是系统稳定运行的关键环节。

硝化反应在自然界的氮循环中起着重要作用，是污水系统生物脱氮的关键反应。而亚硝化反应是整个过程的限速步骤，是由氨氧化菌(AOB)完成的，这个过程包括氨单加氧酶(ammonia monooxygenase,AMO)催化氨成为羟胺，以及羟胺由羟胺氧化酶(Hydroxylamine oxidoreductase,HAO)催化生成亚硝酸盐的过程；因此，HAO的表达量可以作为衡量生物脱氮系统处理能力的指标。

目前，检测HAO多采用荧光定量PCR法，但是该方法表征的是HAO基因的mRNA水平，并不能直接对HAO的蛋白表达水平进行表达，致使无法直接对HAO的表达量进行检测；而利用ELISA法，使HAO抗体与HAO抗原结合，可以直接对蛋白进行定量分析，简洁方便，准确性高；但是现有技术中，并未公开HAO抗体的制备方法。

因此，如何提供一种HAO多克隆抗体的制备方法与应用是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种HAO兔多克隆抗体的制备方法与应用，制备出的多克隆抗体可特异识别氨氧化菌ATCC 19718中的内源Hydroxylamine oxidoreductase蛋白，Hydroxylamine oxidoreductase蛋白的兔多克隆抗体的构建为氨氧化菌中该蛋白的检测提供了物质和技术支撑。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种HAO兔多克隆抗体的制备方法，包括下述步骤：

1)制备HAO重组蛋白：通过原核表达得到HAO重组蛋白；

2)制备HAO抗体血清：将步骤1)所得HAO重组蛋白制备成悬浮液，并对动物进行注射，得到HAO抗体血清；

3)HAO多克隆抗体纯化：采用抗原亲和纯化的方法对HAO抗体血清进行纯化，得到多克隆抗体。

作为本发明优选的技术方案，步骤2)中，将HAO重组蛋白制成悬浮液并进行注射的具体过程为：

首次免疫时，将HAO重组蛋白0.3mg与弗氏完全佐剂混合，对动物进行免疫，第二、三、四次免疫将HAO重组蛋白0.15mg与不完全弗氏佐剂混合，形成油包水的乳浊液，震荡混匀后，吸入针管进行注射。

作为本发明优选的技术方案，步骤2)中，从动物血清中制备HAO抗体的具体过程为：

第1天常采用完全弗氏佐剂免疫动物，在第12、26、40天采用不完全弗氏佐剂进行第二、三、四次免疫，第52天处死动物采血得到抗HAO血清抗体。

一种HAO多克隆抗体的制备方法制备得到的HAO多克隆抗体在制备ELISA法检测Hydroxylamine oxidoreductase蛋白的试剂中的应用。

一种HAO多克隆抗体的制备方法制备得到的HAO多克隆抗体在制备检测HAO试剂盒中的应用。