[发明专利]一种新型溶瘤病毒及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于痘苗病毒天坛株的新型溶瘤病毒及其制备方法和应用，所述病毒的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)区包含SEQ ID NO.1所示AIF‑GM‑CSF的编码序列。本发明将基因治疗的抑瘤效果与病毒治疗的溶瘤效应有效结合起来，制备了一种可高效表达人源AIF‑GM‑CSF基因的溶瘤痘苗病毒。在痘苗病毒天坛株溶瘤病毒发挥溶瘤效应裂解肿瘤细胞的同时，大量表达人的AIF，可使感染的肿瘤细胞大量凋亡；并且大量表达人多GM‑CSF，可招募NK细胞或者DC细胞进入肿瘤内部，杀伤肿瘤或者将肿瘤抗原进行有效提呈，促进杀伤性T细胞的增值分化，发挥多重的抗肿瘤效果。相对于单纯的基因疗法或者病毒疗法，增强了其对恶性肿瘤的杀伤能力。

技术领域

本发明属生物医学技术领域，具体涉及包含经修饰或经改造的人调亡诱导因子以及人中性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（AIF-GM-CSF）基因的新型溶瘤病毒以及所述溶瘤病毒的制备方法和其在抗肿瘤方面的应用。

背景技术

由于经典的肿瘤治疗方案在晚期肿瘤治疗中治疗效果有限且副作用严重，领域一直在不断探索新型抗肿瘤治疗策略。溶瘤病毒选择性的在肿瘤局部感染，既可直接裂解肿瘤细胞，也可通过作用于多个细胞通路以诱导不同形式的细胞死亡，还可打破肿瘤微环境的免疫抑制而诱导长期的肿瘤特异性免疫应答，减少肿瘤的抗性。溶瘤病毒感染肿瘤细胞时可特异性的转运治疗性蛋白进入肿瘤细胞，随病毒复制而增加其所荷载治疗性蛋白的在恶性肿瘤细胞中表达水平。另外，溶瘤病毒生产成本较低因而患者负担的治疗费用少，与化疗与放疗联合使用时，还可以减少放化疗使用剂量进而降低其毒副作用。因此，溶瘤病毒抗肿瘤的治疗策略逐渐引起了广泛关注。

目前多种病毒如腺病毒(adenovirus)、单纯疱疹病毒-1 (herpes simplexvirus-1，HSV-1)、新城疫病毒等已经相继被改造成溶瘤病毒。2006年，来自于人5型腺病毒的溶瘤腺病毒产品(oncorine)，在中国已用于临床治疗鼻咽癌。该溶瘤病毒的E1B-55kD区被删除后，可在p53基因突变的癌细胞中繁殖并杀伤宿主细胞。但是，临床数据显示这种溶瘤腺病毒的治疗效果并不十分理想。美国生物治疗公司Jennerex研制的牛痘溶瘤病毒JX-594，2013年的二期临床试验结果表明，原发性肝癌患者生存时间中间值高剂量组可延长达14 .1个月，低剂量组的患者只有6 .7个月。BioVex生物技术公司研发的基因工程化的单纯疱疹病毒OncoVEX GM-CSF 在选择性地杀灭肿瘤细胞同时，可表达分泌中性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte–Macrophage Colony-Stimulating Factor,GM-CSF)，诱导机体产生系统性免疫应答，杀伤剩余局部肿瘤细胞及其转移的肿瘤细胞。2009年BioVex公布的一项转移性黑色素瘤II期试验的结果显示，50名患者中有26％对治疗有反应，有8名患者完全缓解。2013年3月，安进(Amgen)公布了OncoVex的临床研究数据，证明它能缩减晚期患者的肿瘤负荷，在超过400名试验患者的III期研究中，比同类其他药物更加有效。OncoVex已于2015年10月通过了FDA的批准，成为世界首个上市的溶瘤病毒产品。

前期的研究也表明，目前研制的溶瘤病毒在机体免疫力下降的情况下可能发生变异、进化和重组、出现细胞毒性产物等，因而存在一定的安全隐患。机体内预存的抗溶瘤病毒的免疫反应也是影响安全性的一大难题。此外，溶瘤病毒的杀伤效果、靶向性、以及给药途径都方面依然需要进一步优化，以增强其抗肿瘤作用并减少潜在的毒副作用，使之真正成为治疗肿瘤的利器。

溶瘤病毒靶向肿瘤的选择性可来源于病毒本身对肿瘤细胞的趋向性，也可来源于基因修饰。为进一步增强溶瘤病毒的抗肿瘤效应，国际上采用的主要策略之一是“基因-病毒治疗”，即将外源性治疗基因导入溶瘤病毒，包括诱导细胞凋亡基因、靶向肿瘤微环境的基因和免疫调节基因等。这种策略不仅在病毒治疗研究领域开辟了新途径，也为癌症的基因治疗提供了新的载体，已经被广泛应用于肿瘤生物治疗研究。