[发明专利]基于普通PCR技术的舞毒蛾快速鉴定引物及其应用、鉴定方法

说明书

基于普通PCR技术的舞毒蛾快速鉴定引物及其应用、鉴定方法，属于林业和植物检疫技术领域。该舞毒蛾快速鉴定引物，包括上游引物LD‑F12以及下游引物LD‑R1和LD‑R2，所述LD‑F12的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述LD‑R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述LD‑R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明利用普通PCR技术，基于舞毒蛾线粒体COI基因设计特异性引物，可快速实现舞毒蛾与毒蛾属其他昆虫卵块、幼虫等的鉴定，避免形态鉴定可能产生的混淆。

技术领域

本发明属于林业和植物检疫技术领域，具体涉及基于普通PCR技术的舞毒蛾快速鉴定引物及其应用、鉴定方法。

背景技术

舞毒蛾隶属鳞翅目Lepidoptera裳蛾科Erebidae毒蛾亚科Lymantriinae 毒蛾族Lymantriini毒蛾属Lymantria，是我国口岸进出境检验检疫中的重要检疫害虫。毒蛾属包括多种昆虫，舞毒蛾、木毒蛾、栎毒蛾、枫毒蛾、雪松毒蛾等形态相近，尤其是幼虫形态。

现有针对舞毒蛾的鉴定方法即使用定量PCR技术对亚洲型舞毒蛾、欧洲型舞毒蛾、北美型舞毒蛾进行区分（公开号CN102534024A、CN102534025A）。

现有针对舞毒蛾的鉴定方法只针对舞毒蛾类群进行鉴定，舞毒蛾同一属的其他毒蛾比如木毒蛾、栎毒蛾等在外形非常相似，在进出境检验检疫中经常出现混淆，但目前尚无针对舞毒蛾与毒蛾属其他昆虫的快速鉴定方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种基于普通PCR技术的舞毒蛾快速鉴定引物及其应用、鉴定方法的技术方案。

所述的基于普通PCR技术的舞毒蛾快速鉴定引物，其特征在于包括上游引物LD-F12以及下游引物LD-R1和LD-R2，所述LD-F12的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述LD-R1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述LD-R2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的引物在快速鉴定毒蛾属舞毒蛾中的应用。

所述的基于普通PCR技术快速鉴定毒蛾属舞毒蛾的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）取上游引物LD-F12以及下游引物LD-R1和LD-R2，将上述引物进行组合LD-F12/ LD-R1和LD-F12/LD-R2，分别对舞毒蛾种群和舞毒蛾近缘种进行特异性PCR扩增；

2）取扩增产物进行电泳，染色，成像分析，若引物LD-F12/LD-R1扩增得到的长度约为528bp产物，引物LD-F12/LD-R2扩增得到长度约为756bp的产物，即鉴定为舞毒蛾。

所述的方法，其特征在于所述步骤1）中PCR反应体系为20μL，包括1 μL模板DNA，10μM上下游引物各0.4μL， 2.5mM dNTPs1.6μL，2 μL 10 × PCR buffer，5 U/μL TaqDNApolymerase0.1 μL，13.5 μL ddH₂O， PCR buffer含有Mg^{2 +}；PCR反应条件为：94ºC预变性3min；然后进入循环，94 ºC变性30 s，54ºC退火30 s，72ºC延伸1 min，35个循环；最后72ºC延伸10 min。

本发明利用普通PCR技术，基于舞毒蛾线粒体COI基因设计特异性引物，可快速实现舞毒蛾与毒蛾属其他昆虫卵块、幼虫等的鉴定，避免形态鉴定可能产生的混淆。

附图说明

图1为本发明的引物LD-F12/ LD-R1和LD-F12/ LD-R2在舞毒蛾上的位置示意图；