[发明专利]采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法

说明书

本发明公开了一种采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法。本发明具有操作简便、快速高效、敏感性高、特异性强、有效解决了PCR污染、PCR热不稳定的问题、自动化程度高等特点，比采用其它方法适应性更强、效果更好。且本发明简单易懂，便于操作。

技术领域

本发明涉及生物科学技术领域，特别涉及到采用实时荧光定量 PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法。

背景技术

CTSB(Cathepsin B，组织蛋白酶B)属于溶酶体半胱氨酸抑制剂蛋白酶家族成员，与不同的生化功能和病理障碍有着紧密联系。如在适宜pH<7条件下，在溶酶体中发挥降解蛋白、促进细胞凋亡等生物学功能。在胞外pH适宜条件下，亦能发挥其生物学功能，如巨噬细胞、破骨细胞、成纤维细胞及其他分化细胞。有研究表明组织蛋白酶在人和小鼠体内，CTSB是胚胎正常发育和子宫蜕膜所必需的；还有研究报道CTSB、CTSD等在子宫内膜或妊娠早期绵羊的孕体中表达，还有其他的研究表明CTSB基因也在小鼠的卵泡中表达，可见，CTSB基因对性腺组织的发育起着一定的作用。

实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。与传统的PCR技术相比实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品 Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR 无需内标是建立在两个基础之上的。前人的研究已经表明，CTSB基因对绵羊卵泡发育有一定的影响，但其机理并不清楚；应用实时荧光定量PCR技术，建立黔北麻羊CTSB基因在性腺组织中的表达谱，对于解释CTSB基因在黔北麻羊不同组织中的表达作用机理具有一定的指导作用。

发明内容

针对现有发明材料的不足，本发明提供了一种采用实时荧光定量 PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法，它具有操作简便、快速高效、敏感性高、特异性强、有效解决了PCR污染、PCR 热不稳定的问题、自动化程度高等特点，比采用其它方法适应性更强、效果更好。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法，包括如下步骤：

(1)提取屠宰后的发情期产单羔、产多羔的黔北麻羊母羊下丘脑、垂体、子宫、输卵管和卵巢5种性腺组织的总RNA；采用超微量分光光度计与1％琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA的特异性；

(2)对提取的符合要求的总RNA依据逆转录试剂盒合成cDNA 第一链；并以逆转录后的cDNA第一链为模板，分别对目的基因CTSB 和内参基因β-actin进行普通PCR扩增；

(3)目的基因CTSB上游引物的序列为5'-TGACTCGCATGTA GGTTGC-3'、下游引物的序列为5'-TGGAGACGCTGTAGGAA-3'；内参基因β-actin上游引物的序列为5'-AGATGTGGATCAGCAAGC AG-3'、下游引物的序列为5'-CCAATCTCATCTCGTTTTCTG-3'；用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

(4)将检测出的目的条带切下，切胶回收产物与pMD19-T载体连接，再转化为大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，将鉴定为阳性的菌液测序，将测序正确的菌液进行扩繁与质粒提取，并将获得的重组质粒进行定量稀释，以稀释后的重组质粒作为模板，采用实时荧光定量PCR扩增目的基因CTSB与内参基因β-actin，获得标准曲线与熔解曲线；利用2-ΔΔCt相对定量法计算目的基因CTSB的相对表达量，并检测差异表达量。