[发明专利]采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法

权利要求书

1.一种采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)提取屠宰后的发情期产单羔、产多羔的黔北麻羊母羊下丘脑、垂体、子宫、输卵管和卵巢10个性腺组织的总RNA；采用超微量分光光度计与1％琼脂糖凝胶电泳检测提取总RNA的特异性、完整性以及纯度；

(2)对提取的符合要求的总RNA依据逆转录试剂盒合成cDNA第一链；并以逆转录后的cDNA第一链为模板，分别对目的基因CTSB和内参基因β-actin进行普通PCR扩增；

(3)目的基因CTSB上游引物的序列为5'-TGACTCGCATGTAGGTTGC-3'、下游引物的序列为5'-TGGAGACGCTGTAGGAA-3'；内参基因β-actin上游引物的序列为5'-AGATGTGGATCAGCAAGCAG-3'、下游引物的序列为5'-CCAATCTCATCTCGTTTTCTG-3'；PCR扩增产物使用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

(4)将电泳检测出的目的条带切下，切胶回收产物与pMD19-T载体连接，再转化为大肠杆菌DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，将鉴定为阳性的菌液进行测序，将测序正确的菌液进行扩繁与质粒提取工作，并将获得的重组质粒进行定量稀释，以稀释后的重组质粒作为模板，采用实时荧光定量PCR扩增目的基因CTSB与内参基因β-actin，获得标准曲线与熔解曲线；利用2-ΔΔCt相对定量法计算目的基因CTSB的相对表达量，并检测差异表达量。

2.根据权利要求1所述的采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法，其特征在于：步骤(2)中对目的基因CTSB和内参基因β-actin进行扩增时，PCR程序为：预变性95℃5min，95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，72℃终延伸7min；反应体系为20μL，其中包括：2x Taq PCR Master Mix 10μL，DNA模板2μL，上、下游引物各1μL，ddH₂O 6μL。

3.根据权利要求1所述的采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法，其特征在于：步骤(4)中切胶回收产物与pMD-19T载体进行连接的体系为10μL，其中包括pMD^TM19-T Vector 1μL，切胶回收产物4μL，Solution I连接酶5μL，16℃金属浴连接12h。

4.根据权利要求1所述的采用实时荧光定量PCR技术检测黔北麻羊CTSB基因组织表达谱的方法，其特征在于：步骤(4)中转化为大肠杆菌感受态细胞的方法如下：

1)将大肠杆菌DH5α感受态细胞置于冰上解冻后轻轻摇晃将细胞悬浮；

2)将金属浴过夜连接的连接液加入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并用枪头轻轻将细胞与连接液混匀，放置冰上静置20min；

3)在将其放入42℃水浴锅内恒温加热90s，加热后放置冰上冷却10min；

4)向试管中加入普通液体培养基，放置摇箱内以37℃，200rpm振荡1h；

5)振荡后的体液放入冷冻离心机中5000rpm离心5min，离心管底部有细胞析出，用枪头吸掉上清液，用枪头来回吹打剩余的培养基将细胞与培养基混匀；

6)将细胞悬液均匀的涂在含有X-gal和IPTG的含AMP的固体培养基平板上；

7)将平板放置37℃恒温箱内1h，待平板表面液体干后倒置培养12-16h。