[发明专利]一种具有绿色荧光活性的多物种通用检测蛋白及其应用

说明书

本发明提供一种具有绿色荧光活性的多物种通用检测蛋白及其应用，其特征在于所述检测蛋白包括链球菌蛋白G（SPG）片段和荧光蛋白，将SPG基因的IgG结合片段进行重构，只保留蛋白G能与抗体IgG的Fc端特异性相结合的C3区，并将其分为三组，C3、C3‑D‑C3、C3‑D‑C3‑D‑C3，并都连接EGFP，制备的重组蛋白具有荧光活性与与不同物种抗体结合的双重活性。本发明公开的进化免疫球蛋白结合分子，其可以广谱结合包括人及多种动物总IgG及不同亚类的IgG，与现有技术中的免疫球蛋白结合分子相比，它结合力也比现有的免疫球蛋白结合分子高。

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，特别涉及一种具有绿色荧光活性的多物种通用检测蛋白及其应用。

背景技术

各种传染性疾病大范围的流行传播，对我国的国家安全和人口健康造成严重威胁。发展灵敏、准确的病原分析方法和检测技术对于相关疾病的快速诊断和及时治疗、生物恐怖和突发性公共卫生事件的有效防范和快速处置具有重要意义。经典的微生物分离鉴定麻烦费时，难以应用于致病微生物的现场快速检测；基于病原核酸的检测方法大多具有较高的检测灵敏度，但需要复杂的核酸抽提过程，而且容易出现假阳性；免疫学方法因基于抗体对病原的特异性识别作用而具有较好的特异性，同时操作简单，因此，广泛应用于临床和基础研究的各个领域。常规的免疫分析方法虽然能够实现快速检测，但由于该方法通常通过肉眼识别纳米金聚集显色，其灵敏度较低。针对于此，我们亟需开发一种快速、高灵敏的免疫检测方法。

链球菌蛋白G（SPG）是能与人及多种动物的抗体IgG结合的一种链球菌细胞壁蛋白， SPG从N段开始，有三个同源结构区域A1、A2、A3，每个同源结构都由24个氨基酸组成，同时这三个同源结构被51个氨基酸组成的同源区域B1、B2隔开，接着是一个间隔的区域S，随后是55个氨基酸组成的同源结构区C1、C2、C3，它们之间又被D1和D2区所隔开，C3区之后为亲水区域W，最后为M区（Sjobring，1991）。有研究表明，SPG的三个同源的氨基酸序列C1、C2和C3区域与抗体IgG Fc端的结合相关，并且C1和C2区只有2个氨基酸序列不同，C1和C3区有6个氨基酸序列不同，并且C3区与抗体IgG的结合能力相当于C1区的7倍（Kobatake，1990）。而SPG的A、B区则具有与抗体Fab段结合以及与血清白蛋白结合的活性，被认为会起到干扰抗体与抗原的作用以及带来非特异性反应的问题。

GFP是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色萤光。由于荧光蛋白能稳定在后代遗传，并且能根据启动子特异性地表达，常被用作报告基因。在需要定量或其他实验中慢慢取代了传统的化学染料。增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP）是GFP突变系，可以发射出的荧光强度比GFP大 6 倍以上，因此，比GFP更适合作为 一种报告基因来研究基因表达、 调控、 细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等。

绿色荧光蛋白等标记抗体或G蛋白等活性物质的方法，涉及到化学偶联，偶联后提纯，透析，浓缩等繁琐步骤；而且由于本身生物大分子的特点，偶联的结合位点多样，不仅可能造成绿色荧光蛋白的荧光活性发生改变甚至失活，而且容易造成被标记的生物大分子的活性改变或失活。且由于偶联部位的不确定性，影响了试剂的稳定性。我们的发明采用分子生物学的方法，重新构建了一个自然界不存在的新型双功能分子，重组的G蛋白与绿色荧光蛋白rG-EGFP，构建时不仅设计了连接片段保证两种活性不相互干扰，而且进行了密码子优化及纯化标签。该蛋白由于是通过原核表达获得，产量高，可以通过纯化标签进行亲和层析，纯度得到了保证。提纯的蛋白经过检测，具有与多物种IgG的结合活性，同时具有绿色荧光活性。在应用到试纸条等检测中时，显示了该发明蛋白具有的高灵敏性。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种快速、高灵敏的免疫检测产品及方法，实现高效、高密度的免疫检测。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：