[发明专利]一株高产L-缬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明提供一株通过改造大肠杆菌的代谢途径构建的高产L‑缬氨酸的基因工程菌，从大肠杆菌W3110出发，在其基因组上整合了枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶的编码基因alsS并使其强表达；并在基因组上整合了大肠杆菌ppGpp 3′‑焦磷酸水解酶突变体[R290E，K292D]的编码基因spoT并使其强表达；还敲除了硫胺磷酸合酶的编码基因thiE，构建基因工程菌。本发明解决了L‑缬氨酸合成代谢流偏弱、关键前体物丙酮酸供应不足导致L‑缬氨酸产率较低的问题。

技术领域

本发明属于微生物领域和分子生物学领域，其中涉及一株高产L-缬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

L-缬氨酸属于支链氨基酸，是一种人体必需氨基酸。L-缬氨酸在医学、食品及饲料领域有广泛的应用，具有很高的商业价值。L-缬氨酸在医学方面可以用作抗肿瘤药物，在食品方面可以用作食品添加剂。另外L-缬氨酸已经成为一种重要的饲料用氨基酸。

目前L-缬氨酸的生产方法主要采用以葡萄糖为原料的微生物发酵法。L-缬氨酸合成支路途径从丙酮酸开始，经过以下几步反应形成L-缬氨酸。丙酮酸在乙酰乳酸合酶催化下形成α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸在二羧酸还原异构酶的催化下形成α、β-二羟基异戊酸，该产物经二羟酸脱水酶催化后形成α-乙酰异戊酸，α-乙酰异戊酸在转氨酶作用下形成L-缬氨酸。

系统代谢工程作为一种菌株改良和工艺优化方法，已成功应用于包括L-缬氨酸在内的多种氨基酸代谢育种。在L-缬氨酸产生菌的育种中，谷氨酸棒杆菌是最常见的出发菌株之一。2013年，Hasegawa S等通过重构谷氨酸棒杆菌L-缬氨酸代谢途径，构建了L-缬氨酸生产菌。首先通过化学诱变，选育了突变的关键酶——乙酰乳酸合酶AHAS(G156E)，解除了L-缬氨酸的反馈抑制。随后将L-缬氨酸合成途径中，两步需要以NADPH为辅酶的代谢酶通过点突变和基因替换的方式转变为以NADH为辅酶，平衡了细胞代谢的辅酶需求。该菌株可通过好氧生长结合厌氧代谢的双阶段发酵模式实现L-缬氨酸的积累。虽然这种发酵方式的L-缬氨酸产率高，但该菌株在发酵前期要进行细胞悬液培养、细胞浓缩，对发酵设备要求较高，并且整个发酵过程较复杂，发酵周期较长。

大肠杆菌具有遗传背景清晰，操作较简单等优点，也是一种主要的工业微生物，但应用于L-缬氨酸生产的研究较少。大肠杆菌生产L-缬氨酸的乙酰乳酸合酶有三个同工酶(AHASⅠ、Ⅱ、Ⅲ)，分别由基因ilvBN、ilvGM和ilvIH编码，AHAS受L-缬氨酸的反馈抑制，若不及时把胞内L-缬氨酸运输到胞外，会影响L-缬氨酸合成。2007年，Park JH等在大肠杆菌W3110中引入了突变的AHASⅢ，解除了L-缬氨酸的反馈抑制。随后，过表达了全局调控因子Lrp和转运蛋白YgaZH，构建的菌株可以产生L-缬氨酸7.61g/L。2011年，Park JH等在大肠杆菌W中过表达基因ilvBN^mut、ilvCDE、ygaZH和lrp，L-缬氨酸产量达到60.7g/L。这是目前通过基因工程方法改造大肠杆菌生产L-缬氨酸的最高产量，但与谷氨酸棒杆菌发酵相比，L-缬氨酸合成效率仍较低，不能满足日益增长的市场需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于现有技术中L-缬氨酸合成代谢流偏弱、关键前体物丙酮酸供应不足导致L-缬氨酸产率较低。

为解决上述技术问题，本发明提供一株通过改造大肠杆菌的代谢途径构建的高产L-缬氨酸的基因工程菌。

本发明的技术方案概述如下：

从大肠杆菌W3110出发，在其基因组上整合了枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶(NCBI-Protein ID:NP_391482.2)的编码基因alsS并使其强表达；并在其基因组上整合了大肠杆菌ppGpp 3′-焦磷酸水解酶(NCBI-Protein ID:BAE77643)突变体[R290E，K292D]的编码基因spoT并使其强表达；并敲除其基因组上硫胺磷酸合酶(NCBI-Protein ID:BAE77326.1)的编码基因thiE，构建基因工程菌。