[发明专利]一株高产L-缬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一株高产L-缬氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在大肠杆菌（Escherichia coli ） W3110的基因组上整合了强表达的枯草芽孢杆菌乙酰乳酸合酶的编码基因alsS，和强表达的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的大肠杆菌ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E、K292D的编码基因spoT，并敲除大肠杆菌W3110基因组上硫胺磷酸合酶的编码基因thiE获得。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰乳酸合酶编码基因alsS整合在假基因ydeU位点，并由启动子P_trc启动；所述核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E、K292D的编码基因spoT整合在假基因yeeP位点，并由启动子P_trc启动。

3.权利要求1或2所述基因工程菌用于发酵生产L-缬氨酸的用途，其特征在于，利用所述基因工程菌进行摇瓶发酵：

将菌种活化后制备种子液，按10-15%接种量接种到装有发酵培养基的三角瓶中，37℃，200 r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在6.7-7.0；补加60% m/v葡萄糖溶液维持发酵进行；

所述发酵培养基组成为：葡萄糖 18 g/L，酵母粉 1 g/L，蛋白胨 2 g/L，KH₂PO₄ 2 g/L，柠檬酸钠 1 g/L，MgSO₄•7H₂O 0.7 g/L，FeSO₄•7H₂O 100 mg/L，MnSO₄•H₂O 100 mg/L，V_B1 0.8mg/L，V_H 0.3 mg/L，苯酚红20 mL/L，消泡剂两滴，pH 7.0-7.2。

4.权利要求1或2所述基因工程菌用于发酵生产L-缬氨酸的用途，其特征在于，利用所述基因工程菌进行发酵罐发酵：

将菌种活化后制备种子液，按照15-20%接种量接入发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在6.7左右，温度维持在35℃，控制溶氧在25-30%之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80% m/v的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-5 g/L；

所述发酵培养基组成为：葡萄糖 30 g/L，酵母粉2 g/L，K₂HPO₄ 7 g/L，（NH₄）₂SO₄ 3 g/L，柠檬酸 2 g/L，MgSO₄•7H₂O 1 g/L，蛋氨酸 1 g/L，FeSO₄•7H₂O 30 mg/L，MnSO₄ 10 mg/L，V_B1、VB₃、VB₅、VB₁₂、V_H各1 mg/L，pH 6.5-7.0。

5.一种高产L-缬氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法是采用CRISPR/Cas 9介导的基因编辑技术，包括如下步骤：

（1）以大肠杆菌W3110出发，在大肠杆菌W3110的假基因ydeU位点整合了启动子P_trc与乙酰乳酸合酶编码基因alsS的连接片段P_trc-alsS；

（2）在大肠杆菌W3110的假基因yeeP位点整合了启动子P_trc与核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的ppGpp 3′-焦磷酸水解酶突变体R290E、K292D的编码基因spoT的连接片段；

（3）敲除大肠杆菌W3110基因组上硫胺磷酸合酶的编码基因thiE，获得基因工程菌。