[发明专利]一种测定25-羟基维生素D含量的方法

说明书

本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种测定25‑羟基维生素D含量的方法。本发明利用解离液使生物样本内25‑羟基维生素D从维生素D结合蛋白中解离出来，且所述解离液成分温和，不会对抗体造成破坏，因此可以将生物样本、解离液和荧光微球工作液三者共同孵育，使荧光微球工作液中的抗‑25‑羟基维生素D抗体与生物样本中解离出来的25‑羟基维生素D充分结合，能够有效提高灵敏度，线性范围为3～100ng/mL。

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种测定25-羟基维生素D含量的方法。

背景技术

维生素D是一类脂溶性维生素，属固醇类衍生物，分子中含有环戊烷多氢菲结构。它有多种形式，主要包括维生素D₁、D₂、D₃、D₄和D₅，其中最重要的是维生素D₂(麦角钙化醇，ergocalciferol)和D₃(胆钙化醇，cholecalciferol)，通常所说的维生素D即指这两种形式。维生素D主要的生理功能是促进钙、磷吸收和促进成骨作用，缺乏易导致佝偻病和软骨病，摄入过多会有潜在毒性。

在体内，维生素D需要经过肝脏和肾脏的羟基化作用形成25-羟基维生素D和1,25-二羟基维生素D才能发挥作用，其中25-羟基维生素D是维生素D在体内的主要储存形式，是临床检测的最佳指标。

但是血液中25-羟基维生素D大部分与维生素D结合蛋白结合，需要将其解离下来才能进行检测。液相色谱-质谱/质谱法(即LC-MS/MS方法)是检测25-羟基维生素D的标准检测方法，但设备昂贵，操作复杂，需要专业的操作人员。荧光免疫层析检测方法因其快速、易操作、成本低等优点广泛应用于快检领域。但传统的荧光免疫层析试纸条的荧光微球喷涂到玻璃纤维上，干燥过程中易出现微球聚集、分散不均匀、释放效果差、抗体活性降低或破坏等现象，导致检测结果不准确、波动大或者灵敏度降低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测定25-羟基维生素D含量的方法，本发明提供的方法操作简单且灵敏度高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种测定25-羟基维生素D含量的方法，包括以下步骤：

将生物样本、解离液和荧光微球工作液混合后进行孵育，得到孵育料液；

将所述孵育料液加到检测卡的加样孔中，进行层析反应，得到反应检测卡；

测定所述反应检测卡的荧光强度，根据校准曲线和反应检测卡的荧光强度，得到生物样本中25-羟基维生素D的含量；

其中，所述解离液包括巴比妥钠缓冲液、皂素和吐温-20；

所述荧光微球工作液中的荧光微球包括抗-25-羟基维生素D抗体标记的荧光微球和抗-鸡IgY标记的荧光微球。

优选地，所述巴比妥钠缓冲液的pH值为7.4，浓度为20～200mmol/L；所述解离液中皂素的含量为1～5wt.％，吐温-20的含量为0.5～2wt.％。

优选地，所述荧光微球工作液中的稀释液包括硼酸-硼砂缓冲液、牛血清白蛋白、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和防腐剂。

优选地，所述硼酸-硼砂缓冲液的pH值为8.0，浓度为50mmol/L；所述稀释液中牛血清白蛋白的含量为0.5～2wt.％，海藻糖的含量为0.5～2wt.％，聚乙烯吡咯烷酮的含量为0.5～2wt.％，防腐剂的含量为0.02～0.2wt.％。

优选地，所述抗-25-羟基维生素D抗体标记的荧光微球中，抗-25-羟基维生素D抗体的标记量为50～200μg/mL；所述抗-鸡IgY标记的荧光微球中，抗-鸡IgY的标记量为100～300μg/mL。