[发明专利]一种肿瘤新生抗原免疫原性检测方法及检测平台

说明书

本发明属于细胞培养和免疫原性检测技术领域，尤其涉及一种肿瘤新生抗原免疫原性检测方法及检测平台。具体而言，包括将人外周血单核细胞在体外培养13天、期间加入人类流感病毒肽段，并进行细胞因子、抗原肽段和免疫佐剂刺激活化，最后进行酶联免疫斑点法呈色反应和仪器扫描计数分析以检测肿瘤新生抗原的免疫原性。此外，本发明还涉及上述检测方法及检测平台在生物医学中的应用。与现有方法相比，本发明检测方法及检测平台具有检测耗时短、便利性高、实验细胞消耗少、检测成本低等优势和特点，因此可用于体外高通量检测肿瘤新生抗原的免疫原性。

技术领域

本发明属于细胞培养和免疫原性检测技术领域，尤其涉及一种肿瘤新生抗原免疫原性检测方法及检测平台。具体而言，包括将人外周血单核细胞在体外培养13天、期间加入人类流感病毒肽段，并进行细胞因子和免疫佐剂刺激活化，最后进行酶联免疫斑点法呈色反应和仪器扫描计数分析以检测肿瘤新生抗原的免疫原性。此外，本发明还涉及上述检测方法及检测平台在生物医学中的应用。

背景技术

酶联免疫斑点法(Enzyme-linked immunospot，ELISPOT)发明于1983年，其结合了蛋白质印记法(Western blotting)与酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)技术，能够检测出单一细胞级别分泌的细胞因子。目前在医学研究和临床诊断领域，酶联免疫斑点法已经被用来检测细胞分泌的特殊因子，包含细胞激素或趋化激素，可同时提供定量(活化的细胞数目)与定性(分泌的因子种类)的信息。

与酶联免疫吸附法不同的是，酶联免疫斑点法是在培养皿中培养细胞并直接检测各个细胞的分泌物，因此可使用此技术来确定细胞反应频率，而非检测裂解后溶液中的目标物质整体浓度。酶联免疫斑点法是目前最灵敏的体外细胞检验技术之一，可检验出20至30万个细胞中的一个受活化细胞，其高灵敏度的特性使得其在侦测免疫反应中的特殊少量细胞时十分适用，此外，酶联免疫斑点法还具有高效率、结果读取过程可自动化高通量进行等特性。然而，此检测方法仍有诸多局限，如检测耗时过长，通常需要长达数周的时间，且耗费的实验细胞数量巨大，检测便利性较差等，上述缺陷限制了其在生物医学领域的推广应用。

发明内容

为了克服酶联免疫斑点法的上述缺陷以便将其应用于肿瘤新生抗原免疫原性检测，本发明通过使用人类流感病毒肽段(Flu Matrix Protein 1，序列片段58-66)和植物凝血素(Phytohemagglutinin，PHA)作为阳性对照刺激人外周血单核细胞，建立了稳定可靠的标准化酶联免疫斑点法平台。经过一系列对照试验，反复比较不同细胞培养条件，包括细胞数目、不同的免疫佐剂、不同的树突细胞分化时间、不同细胞因子的处理组合、不同体外培养刺激时间和最后的静止期时间等，最终获得了最佳结果的标准操作流程。

为实现上述目的，一方面，本发明提供了一种肿瘤新生抗原免疫原性检测方法，包括下列步骤：

(1)第一天：将5x10⁵个解冻的人外周血单核细胞培养于含有500μl完整RPMI细胞培养液的24孔培养板中，外加20ng/ml人类白细胞介素-4和100ng/ml粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，放置于37℃细胞培养箱中48小时；

(2)第三天：将不同浓度的人类流感病毒抗原肽段、5ng/ml人类白细胞介素-7和20μg/ml聚肌胞苷酸加入至细胞培养液中；

(3)第五天：将500μl内含10ng/ml人类白细胞介素-7和人类白细胞介素-15以及40U/ml人类白细胞介素-2的RPMI细胞培养液加入至24孔培养板中，使总体积为1ml；

(4)第八天：每三天进行一次细胞培养液更新，取出500μl旧培养液，加入500μl新鲜的内含10ng/ml人类白细胞介素-7和人类白细胞介素-15以及40U/ml人类白细胞介素-2的RPMI细胞培养液；