[发明专利]一种血浆中儿茶酚胺代谢物高效液相色谱串联质谱检测方法

说明书

本发明提供了一种血浆中儿茶酚胺代谢物高效液相色谱串联质谱检测方法，包括样品制备、样品处理、样品检测及结果分析步骤，标准品及质控品采用在牛血清白蛋白中加入儿茶酚胺代谢物标准品进行制备，采用弱阳离子交换96孔板进行样品固相萃取，处理样品，处理后的样品进行高效液相色谱质谱检测，本发明检测方法具有灵敏度高、特异性高，受基质影响程度低，单个样本检测时间短，样本用量少，检测成本低等优点。

技术领域

本发明涉及疾病分析技术领域，具体而言，涉及一种血浆中儿茶酚胺代谢物高效液相色谱串联质谱检测方法。

背景技术

嗜铬细胞瘤和副神经节瘤为起源于神经外胚层嗜铬组织的肿瘤，主要分泌儿茶酚胺。本病的临床表现个体差异甚大,突然发生恶性高血压、心衰或脑出血等。嗜铬细胞瘤大约10％在肾上腺外，10％呈恶性，10％为家族性，10％出现于儿童，10％瘤体在双侧，10％为多发性。临床症状及体征与儿茶酚胺分泌过量有关，表现有高血压、头痛、心悸、高代谢状态、高血糖、多汗。某些患者可因长期高血压致严重的心、脑、肾损害或因突发严重高血压而导致危象，危及生命，但如能及时、早期获得诊断和治疗，是一种可治愈的继发性高血压病。嗜铬细胞瘤在高血压病人中患病率为0.05％～0.2％，发病高峰为20～50岁。

嗜铬细胞瘤的常规诊疗程序是先进行生化检查定性，再通过影像学进行定位诊断，然后手术治疗。血液和尿液中的儿茶酚胺代谢产物—甲氧基肾上腺素(包括甲氧基肾上腺素MN和甲氧基去甲肾上腺素NMN)是目前公认的最好生物学标志物，特别是血浆中游离MN和NMN的检测时首选的嗜铬细胞瘤检查方法，具有高准确性和特异性，对诊断和发现嗜铬细胞瘤具有极高的临床价值。但目前常用的生化检查项目的敏感性和特异性较低，影响了嗜铬细胞瘤的早期诊断。高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)的灵敏度和特异性高，是国际上测定儿茶酚胺及其代谢物的推荐方法和金标准方法。

实验室应用的儿茶酚胺类物质检测方法主要有高效液相色谱同电化学检测、荧光光度检测相结合和高效液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS法)。高效液相色谱同电化学检测、荧光光度检测相结合方法不能消除药物干扰，且许多方法在灵敏度、选择性等方面不能达到样品分析要求。LC-MS/MS法大大提高了灵敏度和选择性，但很多方法也存在方法仪器成本高、方法耐用性不佳、基质干扰仍较显著、分析检测时间过长等缺点。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种血浆中儿茶酚胺代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法，包括如下步骤：

(1)样品制备：

标准品制备：以牛血清白蛋白作为空白基质，加入儿茶酚胺代谢物标准溶液，配制系列已知浓度的儿茶酚胺代谢物标准样品；

质控品制备：以牛血清白蛋白作为空白基质，加入儿茶酚胺代谢物标准溶液，配制低、中、高三个已知浓度的儿茶酚胺代谢物质控样品；

(2)样品处理：样品包括待测人血浆样品、标准品、质控品，处理方法均如下：

A)预处理：取500μL样品，加入15μL内标液，涡旋混匀，再加入50mM乙酸铵溶液500μL，涡旋混匀；

B)固相萃取处理：将步骤A)中预处理样品转移入经过活化平衡的弱阳离子交换96孔板中，静置5分钟后，加入平衡淋洗液1mL，负压或正压至干；再加入1mL甲醇，负压或正压至干；最后分2次分别加入250mL洗脱液，在负压或正压下收集到96孔收集板中，用氮气吹干；

C)样品复溶：将100μL复溶液加入到步骤B)经氮气吹干后的96孔收集板中，加覆96孔板封片，涡旋至少5分钟使残渣充分溶解，在4000rpm下离心5min后待测；

(3)样品检测：取步骤(2)获得的样品10～40μL，自动进样，进行高效液相色谱串联质谱检测；

(4)数据处理及分析：绘制标准曲线，计算回收率、基质效应、精密度，及计算待测人血浆样品儿茶酚胺代谢物浓度。