[发明专利]一种具有红色荧光活性的检测蛋白及其应用

说明书

本发明提供一种具有红色荧光活性的检测蛋白及其应用，其特征在于所述检测蛋白包括链球菌蛋白G（SPG）片段和荧光蛋白，所述链球菌蛋白G（SPG）片段为SPG的C3区段，所述荧光蛋白为优化后的红色荧光蛋白，所述检测蛋白具有荧光活性和与不同物种抗体结合的双重活性。本发明公开的检测蛋白，其可以广谱结合包括人及多种动物总IgG及不同亚类的IgG，与现有技术中的免疫球蛋白结合分子相比，它结合力也比现有的免疫球蛋白结合分子高。

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，特别涉及一种具有红色荧光活性的检测蛋白及其应用。

背景技术

各种传染性疾病大范围的流行传播，对我国的国家安全和人口健康造成严重威胁。发展灵敏、准确的病原分析方法和检测技术对于相关疾病的快速诊断和及时治疗、生物恐怖和突发性公共卫生事件的有效防范和快速处置具有重要意义。经典的微生物分离鉴定麻烦费时，难以应用于致病微生物的现场快速检测；基于病原核酸的检测方法大多具有较高的检测灵敏度，但需要复杂的核酸抽提过程，而且容易出现假阳性；免疫学方法因基于抗体对病原的特异性识别作用而具有较好的特异性，同时操作简单，因此，广泛应用于临床和基础研究的各个领域。常规的免疫分析方法虽然能够实现快速检测，但由于该方法通常通过肉眼识别纳米金聚集显色，其灵敏度较低。针对于此，我们亟需开发一种快速、高灵敏的免疫检测方法。

链球菌蛋白G（SPG）是能与人及多种动物的抗体IgG结合的一种链球菌细胞壁蛋白，最早由Kronvall在1973年报道。A、C、G群链球菌的细胞壁及培养上清液中均含有该蛋白，SPG与葡萄球菌蛋白A（SPA）的特性明显不同。在1984年，Bjorck等人将这种蛋白统称为链球菌蛋白G，并对其进行了分离和纯化。目前，虽然SPA由于具有与抗体Fc端结合的特性，较为广泛的应用于免疫学实验中。然而，SPG与SPA相比，SPG与IgG的结合力更强，结合谱也更广（曹之舫，1989）。

SPG从N段开始，有三个同源结构区域A1、A2、A3，每个同源结构都由24个氨基酸组成，同时这三个同源结构被51个氨基酸组成的同源区域B1、B2隔开，接着是一个间隔的区域S，随后是55个氨基酸组成的同源结构区C1、C2、C3，它们之间又被D1和D2区所隔开，C3区之后为亲水区域W，最后为M区（Sjobring，1991）。有研究表明，SPG的三个同源的氨基酸序列C1、C2和C3区域与抗体IgG Fc端的结合相关，并且C1和C2区只有2个氨基酸序列不同，C1和C3区有6个氨基酸序列不同，并且C3区与抗体IgG的结合能力相当于C1区的7倍（Kobatake，1990）。而SPG的A、B区则具有与抗体Fab段结合以及与血清白蛋白结合的活性，被认为会起到干扰抗体与抗原的作用以及带来非特异性反应的问题。

红色荧光蛋白(Red fluorescent protein，RFP)是香菇珊瑚中分离的一种生物发光蛋白，它是一个由约248个氨基酸组成的蛋白质，RFP发射的荧光强度比最好的绿色荧光蛋白（GFP）突变体更高。具有较强的穿透力，且持续时间长的特点。DsRed2是源于野生型DsRed的一种人工突变基因，该突变基因的表达产物RFP2，蛋白结构与绿色荧光蛋白（GFP）相似。在自然光下就可以发射出红色荧光，是极具潜力的新的可视性报告基因。

红色荧光蛋白等标记抗体或G蛋白等活性物质的方法，涉及到化学偶联，偶联后提纯，透析，浓缩等繁琐步骤；而且由于本身生物大分子的特点，偶联的结合位点多样，不仅可能造成生物大分子的失活，而且影响稳定性。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种快速、高灵敏的免疫检测产品及方法，实现高效、高密度的免疫检测。

为了实现上述技术方案，本发明提供一种能高效的结合IgG的工具蛋白，将SPG基因的IgG结合片段进行重构，只保留蛋白G能与抗体IgG的Fc端特异性相结合的C3区，并连接RFP，制备的重组蛋白具有荧光活性和与不同物种抗体结合的双重活性。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：