[发明专利]一种抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法

说明书

本发明公开了一种抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法；采用对菌株刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中制霉菌素生物合成基因簇聚酮合酶基因nysI的同框缺失技术，获得的基因突变菌株不仅实现了四霉素组分的定向生产，而且使四霉素B产量提高至167％。在此基础之上，通过对基因突变株进行加强表达四霉素生物合成基因簇中后修饰基因tetrK，进一步使四霉素B的产量提高了9％，最终使四霉素B的产量提高至176％，为四霉素B的工业化定向高产奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种生物工程与技术领域的方法，具体涉及一种抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法。

背景技术

多烯聚酮抗生素是链霉菌次级代谢产物中的一大类，因其具有较好的抑菌、抗真菌和杀虫等活性而日益被人们重视。该家族的化合物是在I型聚酮合酶作用下，通过线性的组装方式形成的化合物，该类型化合物具有很强的抗真菌活性，在农业和医药等研究领域具有重要的应用和研究价值。

刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123的次级代谢产物中含有四霉素和制霉菌素两种多烯类抗生素。四霉素是一种广谱、高效的抗真菌剂，主要用于植物病害防治，对多种植物病原菌具有较强的抑制和杀死作用。四霉素与制霉菌素在生物合成过程中均利用如乙酰辅酶A或丙二酰辅酶A等作为聚酮链延伸单元的前体物质，由于制霉菌素对四霉素在生物合成过程中对底物造成的竞争性结合，导致野生型菌株中四霉素产量低下，采用传统的发酵工程手段无法满足四霉素工业化的应用与生产。四霉素包含四霉素A与四霉素B两种组分，四霉素B相比四霉素A具有更好的生物活性，在生物合成过程中四霉素A可以在P450单加氧酶tetrK的催化作用下转化成四霉素B，但野生型菌株中tetrK不能完全将四霉素A转化成四霉素B，导致生物效价低下，使其应用局限。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过基因遗传工程的手段使得刺孢吸水链霉菌北京变种能够定向高产具有抗真菌活性的四霉素B的代谢工程方法。具体是通过基因遗传工程的手段在刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中，在对制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI进行同框缺失的基础上，加强表达四霉素生物合成基因簇后修饰基因tetrK，从而实现定向生产抗真菌四霉素B。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法，所述方法包括如下步骤：

S1、在菌株刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中对制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI进行同框缺失，获得基因nysI同框缺失突变菌株；

S2、在所述同框缺失突变菌株上加强表达四霉素生物合成基因簇中后修饰基因tetrK，获得基因tetrK加强表达突变菌株；

S3、发酵培养所述基因nysI同框缺失突变菌株或基因tetrK加强表达突变菌株，实现定向生产抗真菌四霉素B。

上述方法最终使该菌能够定向生产单一组分的多烯类抗生素四霉素，并且使四霉素A能够更多地转化成抗真菌活性更佳的四霉素B。

步骤S1具体包括步骤如下：

A1、构建用于制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI同框缺失的双交换质粒pJQK503；

A2、将所述质粒pJQK503通过大肠杆菌与链霉菌属间接合转移导入受体菌刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中；

A3、通过对步骤A2获得的突变菌株所提基因组DNA进行PCR验证获得制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI同框缺失突变菌株SY02。