[发明专利]一种抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法

权利要求书

1.一种抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1、在菌株刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中对制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI进行同框缺失，获得基因nysI同框缺失突变菌株；

S2、在所述同框缺失突变菌株上加强表达四霉素生物合成基因簇中后修饰基因tetrK，获得基因tetrK加强表达突变菌株；所述基因tetrK序列如SEQ ID NO.11所示；

S3、发酵培养所述基因nysI同框缺失突变菌株或基因tetrK加强表达突变菌株，实现定向生产抗真菌四霉素B；

步骤S1具体包括步骤如下：

A1、构建用于制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI同框缺失的双交换质粒pJQK503；

所述质粒pJQK503的构建是在质粒pJTU1278的XbaI/HindIII双酶切位点间，分别插入经测序正确的左右同源臂片段△Nys-L与△Nys-R；且同源臂片段△Nys-L是插入XbaI/BspTI酶切位点之间，同源臂片段△Nys-R是插入BspTI/HindIII酶切位点之间；同源臂片段△Nys-L的序列如SEQ ID NO.5所示；同源臂片段△Nys-R的序列如SEQ ID NO.6所示；

A2、将所述质粒pJQK503通过大肠杆菌与链霉菌属间接合转移导入受体菌刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中；

A3、通过对步骤A2获得的突变菌株所提基因组DNA进行PCR验证获得制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI同框缺失突变菌株。

2.根据权利要求1所述的抗真菌四霉素B定向高产的代谢工程方法，其特征在于，步骤S2具体包括步骤如下：

B1、构建用于加强基因tetrK表达的整合型质粒pJQK509；

B2、将所述质粒pJQK509通过大肠杆菌与链霉菌间属间接合转移导入受体菌基因nysI同框缺失突变菌株中；

B3、通过对步骤B2获得的突变菌株进行阿伯拉霉素抗性验证及PCR验证筛选得到基因tetrK加强表达突变菌株；

所述质粒pJQK509的构建是在质粒pSET152-KasOp*的BglII/NotI双酶切位点间插入经测序正确的基因tetrK；所述质粒pSET152-KasOp*是将强启动子KasOp*片段经BamHI/BglII双酶切插入至整合型质粒pSET152获得的。

3.一种定向高产抗真菌四霉素B的突变菌株，其特征在于，所述突变菌株为：

在菌株刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中对制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI进行同框缺失，获得的基因nysI同框缺失突变菌株；具体包括步骤如下：

A1、构建用于制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI同框缺失的双交换质粒pJQK503；

所述质粒pJQK503的构建是在质粒pJTU1278的XbaI/HindIII双酶切位点间，分别插入经测序正确的左右同源臂片段△Nys-L与△Nys-R；且同源臂片段△Nys-L是插入XbaI/BspTI酶切位点之间，同源臂片段△Nys-R是插入BspTI/HindIII酶切位点之间；同源臂片段△Nys-L的序列如SEQ ID NO.5所示；同源臂片段△Nys-R的序列如SEQ ID NO.6所示；

A2、将所述质粒pJQK503通过大肠杆菌与链霉菌属间接合转移导入受体菌刺孢吸水链霉菌北京变种CGMCC4.1123中；

A3、通过对步骤A2获得的突变菌株所提基因组DNA进行PCR验证获得制霉菌素生物合成基因簇中聚酮合酶基因nysI同框缺失突变菌株；

或是在所述同框缺失突变菌株上加强表达四霉素生物合成基因簇中后修饰基因tetrK，获得的基因tetrK加强表达突变菌株；所述基因tetrK序列如SEQ ID NO.11所示。

4.一种定向高产抗真菌四霉素B的突变菌株，所述突变菌株为刺孢吸水链霉菌北京变种(Streptomyces hygrospinosus var.beijingnsis)，保藏编号为CGMCC NO.18241。

5.一种定向高产抗真菌四霉素B的突变菌株，所述突变菌株为刺孢吸水链霉菌北京变种(Streptomyces hygrospinosus var.beijingnsis)，保藏编号为CGMCC NO.18242。