[发明专利]基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法

权利要求书

1.一种基于铜离子荧光探针间接竞争法检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于，包括如下步骤：

合成羧基化硫化铜，将所述的羧基化硫化铜偶联赭曲霉毒素A单克隆抗体形成羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体的免疫信号标记物；

在黑色聚苯乙烯微孔板上固定赭曲霉毒素A抗原，用牛血清白蛋白封闭未反应的活性位点，在均相反应体系中，加入待测样品后，所述待测样品中的赭曲霉毒素A抗原和赭曲霉毒素A竞争结合羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物上的赭曲霉毒素A单克隆抗体；

将未与黑色聚苯乙烯微孔板固定赭曲霉毒素A抗原结合的羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物用10mmol/L磷酸盐缓冲液洗掉，加入0.01mol/L盐酸溶液将黑色聚苯乙烯微孔板固定赭曲霉毒素A抗原结合的羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记的铜离子溶出，加入铜离子荧光探针催化铜离子进行荧光定量检测；

所述合成羧基化硫化铜纳米颗粒包括如下步骤：

将0.01-1mmol氯化铜加入到100-150mL超纯水中并与0.1-0.5mol的巯基乙酸混合搅拌15-25min，用0.5-1M的氢氧化钠将PH调节至8.5-9.0，然后向混合液中加入0.5-5mol的硫代乙酰胺，该反应过程在50-60℃下保持5-6h并通入氮气保护，随后，停止反应并离心。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的将羧基化硫化铜纳米颗粒偶联赭曲霉毒素A单克隆抗体形成羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物包括如下步骤：

将100μL浓度为20-32mg/mL新配制的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶液与1ml羧基化硫化铜纳米颗粒悬浮液充分混合活化羧基化硫化铜纳米颗粒表面的羧基，在室温下震荡反应2-3h，离心除去上清液，加入1mL浓度为200-250μg/mL赭曲霉毒素A单克隆抗体，在4℃温度下震荡孵育12h，随后将反应液离心，用10mmol/L磷酸盐缓冲液洗涤3次，得到羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，赭曲霉毒素A抗原的添加量为30μg/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应时间为60min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应温度为37℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物的添加量为0.7mg/mL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的荧光定量测定包括步骤：

建立标准曲线

加入200μL浓度为2.5-5％的戊二醛黑色聚苯乙烯微孔板内使黑色聚苯乙烯微孔板表面氨基活化，室温下震荡2h后用磷酸盐缓冲液洗涤三次；

将50μL的赭曲霉毒素A抗原浓度为30μg/mL加入到氨基活化完的黑色聚苯乙烯微孔板中，并在37℃孵育2-3h以固定赭曲霉毒素A抗原，然后用磷酸盐缓冲液洗涤3次以除去物理吸附的赭曲霉毒素A抗原，加入120μL浓度为1-5％的牛血清白蛋白溶液封闭未反应的活性位点，再次用磷酸盐缓冲液洗涤3次；

向固定有赭曲霉毒素A抗原的黑色聚苯乙烯微孔板的反应室中加入50μL浓度为0.7mg/mL的羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物物和50μL含有梯度浓度的赭曲霉毒素A在37℃竞争反应60min，随后用磷酸盐缓冲液洗涤3次，所述的梯度浓度包括0pg/mL，10pg/mL，1×10²pg/mL，1×10³pg/mL，1×10⁴pg/mL，1×10⁵pg/mL，1×10⁶pg/mL；

在黑色聚苯乙烯微孔板的反应室中加入200μL浓度为0.1mol/L的盐酸溶液，溶解羧基化硫化铜纳米颗粒-赭曲霉毒素A单克隆抗体免疫信号标记物的铜离子在37℃震荡反应30min，再加入5μL浓度为0.5mg/mL的罗丹明6G酰胺硫脲(铜离子荧光探针)继续震荡反应30-45min后进行荧光定量检测，根据所述的梯度浓度的荧光定量检测结果绘制标准曲线。