[发明专利]一种基于RT-LAMP-LFD检测猕猴桃褪绿环斑相关病毒的快速检测方法

说明书

本发明公开了一种基于RT‑LAMP‑LFD检测猕猴桃褪绿环斑相关病毒(Actinidia chlorotic ringspot‑associated virus,AcCRaV)的引物及检测方法；引物包括内引物：FIP和BIP和外引物：F3和B3。检测方法包括以下步骤：S1、提取猕猴桃待检测样品RNA；S2、将提取的猕猴桃待检测样品RNA反转录为cDNA；S3、以猕猴桃待检测样品cDNA为模板，进行等温扩增；S4、利用LFD试纸条对步骤S3所得等温扩增物进行检测，判断猕猴桃待检测样品是否含有猕猴桃褪绿环斑相关病毒。本发明根据猕猴桃褪绿环斑相关病毒外壳蛋白核苷酸序列设计LAMP引物，实现了对猕猴桃褪绿环斑相关病毒的快速检测，可以在猕猴桃植株或组培苗中快速鉴定出是否含有该病毒，进而达到检测、监测、预警以及采取针对性措施的目的，减少病害带来的损失。

技术领域

本发明属于植物病毒检测技术领域，特别涉及一种基于RT-LAMP-LFD检测猕猴桃褪绿环斑相关病毒的快速检测方法。

背景技术

猕猴桃是全球重要的园艺产品之一，因其果肉含有丰富的维生素C、矿物质及膳食纤维，深受大众的青睐。2017年，世界猕猴桃产量已达到403万吨，但病害的侵染会影响猕猴桃的产量和质量，甚至影响猕猴桃产业的健康发展。病毒病是一种潜伏期长、在生产上存在巨大隐患的病害。猕猴桃褪绿环斑相关病毒(Actinidia chlorotic ringspotsassociated virus,ACRaV)为的欧洲花楸环斑病毒属的负义单链RNA病毒。在自然条件下该病毒可侵染猕猴桃，叶片呈现褪绿斑驳、褪绿环斑和叶脉黄化等症状，对果树的正常生长发育产生一定的影响。同时，我国在湖北，陕西，四川等地区的猕猴桃栽品种中均有检测到该病毒。目前，针对猕猴桃病毒病目前尚无药剂防治，一旦感染将终身携带病毒，因此，病毒对猕猴桃的潜在威胁不容忽视。

果树病毒的检测是病毒病害预测、预报及防治的关键环节。目前病毒病的检测技术主要有普通RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、酶联免疫吸附测定(ELISA)、电子显微镜检测等方法。

1、聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)，它是根据靶基因序列设计1对特异的引物，在体外模拟DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列的引物，由变性-退火-延伸三个基本反应步骤组成。在2-3h内即实现对靶基因扩增放大几百万倍。

2、实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR)，该方法是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，通过荧光信号标记跟踪PCR产物，可对靶基因的扩增情况进行实时监测。

上述两种技术对仪器设备要求较高，需要能够实现PCR三个基本反应的普通PCR仪器，一般的PCR扩增仪器设备价格都在2-3万不等，定量PCR设备价格更高；同时荧光染料或荧光标记的特异性探针价格昂贵，扩增效果的检测同样需要特定的检测仪器，这些设备价格十分昂贵，且扩增的试剂价格高、反应所需的时间较长。导致检测总成本高，不适用于田间样品的快速检测。

3、酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是最常用的病毒血清学检测方法，于20世纪70年代开始应用于植物病毒检测。该技术特异性较强并具有高敏感度，操作简单、准确、快速。ELISA利用抗体和抗原特异性结合的原理作为一个检测系统。该方法的主要制约因素是需要相应的特异抗体，抗体的制作过程较为复杂，特异抗体的准备过程繁琐，耗时耗力，需要花费几个月不等的时间；虽然有些抗体可以商业购买，但是价格昂贵。同时，该病毒为新报道病毒，目前还未商品化的抗体。

4、电子显微镜检测是通过电镜了解病毒结构、病毒的侵染、复制等。电镜是判断病毒是否存在最直观的检测方法。其检测结果的准备性依赖于电镜的品质，先进的仪器设备往往价格昂贵。同时，检测人员必须掌握良好的电镜操作技术及病毒学知识。

发明内容