[发明专利]一种基于RT-LAMP-LFD检测猕猴桃褪绿环斑相关病毒的快速检测方法

权利要求书

1.基于RT-LAMP-LFD检测猕猴桃褪绿环斑相关病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提取猕猴桃待检测样品RNA；

S2、将提取的猕猴桃待检测样品RNA反转录为cDNA；

S3、以猕猴桃待检测样品cDNA为模板，配于引物FIP、BIP、F3和B3进行等温扩增；进行等温扩增时，所述扩增反应体系为：3.5μL检测反应缓冲液10xTermoPol Buffer、1.5μL终浓度为6mmol/L 的MgSO₄、2.5μL终浓度为1 mmol/L的dNTP MIX、2μL终浓度为0.8μmoL/L的内引物FIP、2μL终浓度为0.8μmoL/L的内引物BIP、0.5μL终浓度为0.2μmoL/L外引物F3和0.5μL终浓度为0.2μmoL/L外引物B3、1μL终浓度为320U/mL的Bst DNA聚合酶、1μL样品cDNA模板，无菌水补足25μL；

FIP和BIP的5′末端分别用异硫氰酸荧光素标记与生物素标记，各引物的序列分别如下：

F3：CTTTTGTAAGATCATGCTTCCT，如SEQ ID NO.1所示；

B3：TCTATTTCTATAGTGAATCGTCTTG，如SEQ ID NO.2所述；

FIP：FITC- GGTTAGATTGGAATGTCGTAAAGCTACCAGTGAATTTACAATCTCAG，如SEQ ID NO.3所示；

BIP：Biotin- AACTCATATCCTGGAACAACCATCCAGGACAAATGAGGCTACC，如SEQ ID NO.4所示；

具体反应过程为：将配置好的扩增反应体系配制于PCR管中，将PCR管中混合液瞬时离心混匀，于62℃的恒温条件下反应60min，然后将反应混合液再置于80℃恒温条件下反应10min；

S4、利用LFD试纸条对步骤S3所得等温扩增物进行检测，判断猕猴桃待检测样品是否含有猕猴桃褪绿环斑相关病毒；利用LFD试纸条对步骤S3所得等温扩增物进行检测，具体实现方法为：从步骤S3得到的反应混合液中吸取5μL混合液加入到100μL LFD Buffer中混匀，将LFD试纸条浸入其中，反应5分钟后读取检测结果；若LFD试纸条出现两条红色条带则表明检测结果为阳性，猕猴桃待检测样品含有猕猴桃褪绿环斑相关病毒；LFD试纸条仅在质控线出现红色条带表明检测结果呈阴性，猕猴桃待检测样品不含猕猴桃褪绿环斑相关病毒。

2.根据权利要求1所述的基于RT-LAMP-LFD检测猕猴桃褪绿环斑相关病毒的快速检测方法，其特征在于，所述步骤S1包括以下子步骤：

S11、取猕猴桃样品置于灭菌预冷研钵中，加入液氮后，快速研磨成粉末；

S12、将100 mg步骤S11得到的猕猴桃样品粉末放入1.5mL离心管中，加入1mL 65℃预热的2%的CTAB提取液，震荡混匀，然后放置于65℃的水浴中20min，每隔2min颠倒混匀一次；

S13、在4℃环境中，于10000rpm转速下离心5min，将700μL上清液转移至新离心管；

S14、加入700μL苯酚、氯仿和异戊醇混合溶液，剧烈震荡混匀，所述苯酚、氯仿和异戊醇混合溶液中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1；

S15、在4℃环境中，于12000rpm转速下离心10min，然后将400μL上清液转移至新离心管；

S16、加入400μL的预冷的6mol/L的LiCL溶液，并在-20℃环境中静置1h；

S17、在4℃环境中，于12000rpm转速下离心10min，然后静置5min，倒掉上清液，沉淀用70％乙醇洗涤2次，并在室温下干燥3~5min；

S18、加入50μL DEPC处理水溶解步骤S17得到的产物，然后-20℃保存备用。