[发明专利]一种肉制品中PCR反应检测鼠源性成分的体系及方法

权利要求书

1.一种肉制品中PCR反应检测鼠源性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提取待测样品DNA；

S2、设计引物和荧光标记探针：以16S rRNA基因为参考，从GenBank中获取基因序列作为模板，合成引物和荧光标记探针；

上游引物F的碱基序列：

5’-TCCAGGTCGGTTTCTATC-3’；

下游引物R的碱基序列：

5’-TCTGCCACCCTAATAACC-3’；

荧光标记探针序列P的碱基序列：

5’-FAM-AGTACGAAAGGACA-MGB-3’；

S3、建立实时荧光PCR反应体系：将步骤S1提取的待测样品DNA作为模板；将实时荧光PCR反应混合液、所述DNA模板、所述上游引物、所述下游引物、所述荧光标记探针、Rox参比染料混合并采用双蒸水补足，建立所述实时荧光PCR反应体系；

S4、PCR扩增反应：将所述实时荧光PCR反应体系置于95℃的温度条件下进行预变性反应；再将置于95℃的温度条件下进行变性反应，并于60℃的温度条件下退火，依次循环30～45次，于60℃收集荧光信号；

S5、分析鼠源性成分：测定并计算实时荧光PCR反应物的平均Ct值，并判断待测样品中是否含有鼠源性成分；

当Ct值≤35.0，则判定为待测样品含有鼠源性成分；

当Ct值≥40.0，则判定为待测样品不含有鼠源性成分；

当35.0＜Ct值＜40.0，则重复步骤S1～S4，当再次扩增后Ct值仍为＜40.0，则判定待测样品含有鼠源性成分；当再次扩增后Ct值≥40.0，则判定为待测样品不含有鼠源性成分。

2.根据权利要求1所述的肉制品中PCR反应检测鼠源性成分的方法，其特征在于，所述S1步骤包括以下步骤：取待测样品于离心管中，加入裂解液，进行离心反应并于离心后取其上清液；加入溶剂混匀；加入沉淀剂以形成沉淀，去除上清液，并对所述沉淀进行洗涤，晾干；加入溶剂溶解所述沉淀，制成DNA溶液并于-20℃保存待用；

或者，所述S1步骤包括采用DNA提取试剂盒，提取待测样品的组织中的基因组DNA。

3.根据权利要求2所述的肉制品中PCR反应检测鼠源性成分的方法，其特征在于，所述DNA溶液的浓度为10μg/mL～100μg/mL，且A260/A280吸光值比在1.7～1.9之间。

4.根据权利要求1所述的肉制品中PCR反应检测鼠源性成分的方法，其特征在于，在所述S3步骤中，所述上游引物的浓度为10μmol/L。

5.根据权利要求1所述的肉制品中PCR反应检测鼠源性成分的方法，其特征在于，在所述S3步骤中，所述下游引物的浓度为10μmol/L。

6.根据权利要求1所述的肉制品中PCR反应检测鼠源性成分的方法，其特征在于，在所述S3步骤中，所述荧光标记探针的浓度为10μmol/L。

7.根据权利要求1所述的肉制品中PCR反应检测鼠源性成分的方法，其特征在于，在所述S3步骤中，所述上游引物与所述荧光标记探针的用量比例可以为1：1；

所述下游引物与所述荧光标记探针的用量比例可以为1：1。

8.根据权利要求3所述的肉制品中PCR反应检测鼠源性成分的方法，其特征在于，在所述S3步骤中，各组分的体积比为：

实时荧光PCR反应混合液：50％；

上游引物：4％；

下游引物：4％；

荧光标记探针：4％；

待测样品DNA模板：4％；

Rox参比染料：1％

双蒸水：余量。

9.根据权利要求1所述的肉制品中PCR反应检测鼠源性成分的方法，其特征在于，在所述S4步骤中，通过将所述实时荧光PCR反应体系置于荧光PCR仪上并设定对应参数以进行PCR扩增。

10.一种肉制品中PCR反应检测鼠源性成分的体系，应用于权利要求1至9任一项所述的肉制品中PCR反应检测鼠源性成分的方法，其特征在于，包括实时荧光PCR反应混合液、上游引物、下游引物、荧光标记探针、待测样品DNA模板、Rox参比染料、双蒸水；

其中，上游引物F的碱基序列：

5’-TCCAGGTCGGTTTCTATC-3’；

下游引物R的碱基序列：

5’-TCTGCCACCCTAATAACC-3’

荧光标记探针序列P的碱基序列：

5’-FAM-AGTACGAAAGGACA-MGB-3’。