[发明专利]一种牙囊干细胞的鉴定方法、引物组及试剂盒

说明书

本发明提供了一种牙囊干细胞的鉴定方法、引物组及试剂盒，本发明根据牙囊干细胞的蛋白组学结果，针对HEXB基因，设计特异性引物，将所述特异性引物用于牙囊干细胞与其他相似来源干细胞的区分鉴定，由于引物的特异性高，不受样本的异质性的干扰，结果稳定、可靠，所述鉴定方法包括提取细胞总RNA，反转录获取cDNA模板以及实时荧光定量PCR。该方法不需要进行基于荧光抗体的表面标志物鉴定，节省了大量的时间和仪器试剂成本，并且本发明所述鉴定方法灵敏度好，对于牙囊干细胞与其他干细胞的区分和牙科组织工程具有很高的参考价值，适于推广应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种牙囊干细胞的鉴定方法、引物组及试剂盒。

背景技术

HEXB基因，长45kb，包含14个外显子。基因的5'侧翼区含有功能性HEXB基因启动子，且该序列富含GC，具有多个GC盒和一个CAAT盒，存在几种启动子元件，包括Sp1，AP2，CAAT和TATA基序。而当HEXB基因突变时，会导致酶的功能丧失并导致严重溶酶体贮积病，即是Sandhoff病。HEXB基因编码氨基己糖苷酶B，参与神经退行性疾病，枫糖尿病或桑德霍夫病，被证明为桑德霍夫病的疾病标志物而被广泛研究。氨基己糖苷酶通过末端β-葡糖苷键连接的N-乙酰葡糖胺和N-乙酰半乳糖胺的释放参与糖脂、糖蛋白和蛋白多糖的溶酶体降解。

牙齿上存在多种组织。牙囊是附着牙齿外胚的间充质结缔组织，围绕在牙釉质和牙乳头周围，能够起到调节破骨细胞和成骨细胞的萌生的作用。2004年，德国生物学家Morsczeck首次从牙囊组织中分离出具有高度增殖活性和分化潜能的前体细胞，并通过标志物鉴定了牙囊干细胞。研究发现牙囊干细胞来源于神经嵴，能够形成牙周韧带、牙本质和牙槽骨。通过诱导实验证明牙囊干细胞能够分化形成成骨细胞，脂肪细胞，心肌细胞，软骨细胞，神经元，肝细胞，唾液腺细胞核导管细胞。其中，牙囊干细胞形成骨和牙本质相关细胞和组织的能力得到广泛研究和认可，因此成为牙科组织再生工程中重要的材料。生物学特性研究还发现牙囊干细胞在免疫调节中起作用。

相比于其他牙齿来源干细胞，牙囊干细胞的组织材料更加容易得到，因为在再生医学领域是潜在的临床治疗手段。但是因为口腔环境复杂，牙齿上存在多种组织，分离得到的成纤维状细胞不一定是牙囊干细胞，而要鉴定牙囊干细胞，需要从数个表面标志物同时鉴定，需要比较全面的抗体组合，数量庞大，成本高昂。而如今市场上还没有相关鉴定牙囊干细胞的产品，缺少一种高效，稳定且方便快捷的方法进行牙囊干细胞的鉴定。

发明内容

针对本领域存在的问题，经过蛋白质组学以及荧光定量PCR实验，发现HEXB在牙囊干细胞中的蛋白水平和mRNA水平都存在显著性的表达升高。因此，以HEXB为检测靶标，本发明提供一种牙囊干细胞的鉴定方法、引物组及试剂盒，通过该方法可实现高效、稳定、快速方便的鉴定牙囊干细胞。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种牙囊干细胞的鉴定方法，包括来源于口腔组织的干细胞总RNA的提取、反转录获取cDNA模板，再利用测定HEXB基因表达水平的特异性引物进行荧光定量PCR扩增，根据扩增结果进行统计学检验，用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为参考基因组(ΔCt)将Ct值标准化，并使用建立的基于效率的ΔΔCt方法将每个样品与进行比较，为了评估表达强度，将归一化的Ct值(ΔCt)转换为归一化的表达值，根据下式：EN＝2^(-ΔCt)，计算2^(-ΔΔCt)，作图分析，HEXB基因mRNA相对高表达的来源于牙囊组织的成纤维状细胞，即是牙囊干细胞。

进一步的，所述细胞总RNA的提取具体步骤为：

细胞倒去培养基，用已过滤的PBS洗2-3次，加入Trizol溶液用枪吹散贴附在培养皿/瓶上的细胞，待观察到细胞明显分散，转移到离心管中，震荡后室温静置，加入氯仿，震荡混匀后室温静置分层，离心，此时样品会明显分成3层；吸取上层水相，加入异丙醇混匀，室温静置，离心，弃上得到RNA沉淀，加入无水乙醇，洗1-3次，晾干或者吹干，将干燥后的RNA沉淀溶解于DEPC处理水或无菌水中，吹匀，即得到细胞总RNA。