[发明专利]荧光假单胞菌荧光定量PCR快速检测方法及试剂盒和应用

说明书

本发明公开了一种荧光假单胞菌荧光定量PCR快速检测方法及试剂盒和应用。该方法及试剂盒通过对待检样品进行增菌获得的基因组DNA与引物和相应的探针混合，对样品中的荧光假单胞菌进行荧光定量PCR检测，检测特异性强，适应性广；检测方法快速、灵敏度高，适用于高通量筛检；可应用于样品中尤其是食品中荧光假单胞菌的高通量筛检。

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体而言，涉及一种荧光假单胞菌荧光定量PCR快速检测方法及试剂盒和应用。

背景技术

荧光假单胞菌(PseudomonasFluorescens)是一种嗜冷微生物，在冷藏的生肉、生牛乳等高蛋白高脂肪的食品中是导致腐败的优势菌种。由于荧光假单胞菌能大量分泌耐热脂肪酶、蛋白酶，经过加热杀菌后，残留的耐热蛋白酶和脂肪酶仍有部分活性，可破坏食品的风味品质，缩短食品的货架期。随着人们生活水平的提高和饮食习惯的变化，荧光假单胞菌对人类健康的潜在威胁日益扩大。建立快速、准确的荧光假单胞菌检测方法对完善食品安全监测体系有重要的意义。

目前荧光假单胞菌的检测仍以传统培养法为“金标准”，包括样品前处理、选择性增菌、选择性平板分离、生理生化特征实验几个步骤，实验周期至少需要4天，不适用于大量快速检测。荧光定量PCR技术检测速度快，特异性和灵敏度高，且实现了定量检测。近年来，荧光定量PCR方法已被广泛应用各类病源菌的快速检测中。但截至目前，尚未有研究者针对荧光假单胞菌开发TaqMan探针法荧光定量PCR检测体系。

发明内容

本发明的一个目的在于提供荧光假单胞菌荧光定量PCR快速检测方法。

本发明的另一个目的在于提供荧光假单胞菌荧光定量PCR快速检测试剂盒。

本发明的第三个目的在于提供上述检测方法和试剂盒在检测中的应用。

为实现上述第一个目的，本发明提供的荧光假单胞菌荧光定量PCR快速检测方法，包括以下步骤：

(1)应用选择性增菌液中对待检样品进行增菌，并采用苯酚-氯仿-异戊醇法或煮沸法提取细菌基因组DNA；

(2)将步骤(1)获得的基因组DNA与引物和相应的探针混合，进行荧光定量PCR检测，其中所述引物和探针如下：

以荧光假单胞菌pf SBW25的gyrB基因为模板，使用软件primer express3.0设计特异性检测引物和探针，其中检测引物gyrB-F序列为 5’TGCGGTCAACCAGGTGTTCC3’，gyrB-R序列为 5’CGAGATAATCGCGGTCAGG3’，探针gyrB-taqmen序列为 5’CATCCAGCGTGAAGACGGCATCG3’。

在本发明中，待检样品是潜在可能含有荧光假单胞菌的离体样品。由于荧光假单胞菌是食品中的主要腐败菌，因此优选样品来自于食品，如样品是食品，或者样品是食品的细菌平板培养物等。

荧光定量PCR反应体系中探针的浓度对PCR反应效率影响较大，根据本发明的发明人的研究，taqman探针的终浓度为500nmol/L。

荧光定量PCR的反应过程是本领域技术人员所能掌握的，每个循环一般包括在92-96℃的变性、低温退火和72℃左右的延伸过程，其中最多变的是退火的温度。根据本发明人研究，最优选的实时RT-PCR的过程为36 个循环，其中每个循环为变性94℃/45s，退火57℃/45s，延伸72℃/45s。

为实现上述第二个目的，本发明提供了荧光假单胞菌荧光定量PCR快速检测试剂盒。所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括检测引物和探针，其中检测引物gyrB-F序列为 5’TGCGGTCAACCAGGTGTTCC3’，gyrB-R序列为 5’CGAGATAATCGCGGTCAGG3’，探针gyrB-taqmen序列为 5’CATCCAGCGTGAAGACGGCATCG3’。